వార్తలు

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ సంస్కరణకు పరిమిత CSS మద్దతు ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).ఈ సమయంలో, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా రెండర్ చేస్తాము.
సక్రియం చేయబడిన ఈస్టర్లు లేదా ఫినాక్సీ రాడికల్స్ ఆధారంగా ఎంజైమాటిక్ సామీప్య లేబులింగ్ పద్ధతులు సజీవ కణాలలో సబ్ సెల్యులార్ ప్రోటీమ్‌లు మరియు ప్రోటీన్ ఇంటరాక్టర్‌లను మ్యాప్ చేయడానికి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడతాయి.అయినప్పటికీ, యాక్టివేట్ చేయబడిన ఈస్టర్‌లు తక్కువ రియాక్టివ్‌గా ఉంటాయి, ఫలితంగా విస్తృత లేబులింగ్ వ్యాసార్థం ఏర్పడుతుంది మరియు పెరాక్సైడ్ చికిత్స ద్వారా ఉత్పన్నమయ్యే ఫినాక్సీ రాడికల్‌లు రెడాక్స్ మార్గాల్లో జోక్యం చేసుకోవచ్చు.miniSOG ఫోటోసెన్సిటైజర్ ప్రోటీన్‌ను ఆసక్తి ఉన్న ప్రోటీన్‌తో జన్యుపరంగా లింక్ చేయడం ద్వారా అభివృద్ధి చేయబడిన సామీప్య లేబులింగ్ డిపెండెంట్ ఫోటోయాక్టివేషన్ (PDPL) పద్ధతిని ఇక్కడ మేము నివేదిస్తాము.బ్లూ లైట్ ద్వారా ప్రేరేపించబడుతుంది మరియు ఎక్స్‌పోజర్ సమయం ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది, సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది మరియు అనిలిన్ ప్రోబ్ ద్వారా హిస్టిడిన్ అవశేషాల యొక్క స్పాటియోటెంపోరల్‌గా పరిష్కరించబడిన లేబులింగ్ సాధించబడుతుంది.మేము ఆర్గానెల్లె-నిర్దిష్ట ప్రోటీమ్ మ్యాపింగ్ ద్వారా దాని అధిక విశ్వసనీయతను ప్రదర్శిస్తాము.TurboIDతో PDPL యొక్క ప్రక్క ప్రక్క పోలిక PDPL యొక్క మరింత నిర్దిష్టమైన మరియు సమగ్రమైన ప్రోటీమిక్ కవరేజీని చూపుతుంది.తర్వాత, మేము వ్యాధి-అనుబంధ ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ కోక్టివేటర్ BRD4 మరియు E3 పార్కిన్ లిగేస్‌లకు PDPLని వర్తింపజేసాము మరియు గతంలో తెలియని ఇంటరాక్టర్‌లను కనుగొన్నాము.ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ స్క్రీనింగ్ ద్వారా, పార్కిన్ కోసం రెండు తెలియని సబ్‌స్ట్రేట్‌లు, Ssu72 మరియు SNW1 గుర్తించబడ్డాయి, దీని క్షీణత సర్వవ్యాప్తి-ప్రోటీసోమ్ మార్గం ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం చేయబడింది.
ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌ల యొక్క ఖచ్చితమైన క్యారెక్టరైజేషన్ అనేక ప్రాథమిక సెల్యులార్ ప్రక్రియలకు ఆధారం.అందువల్ల, ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యల యొక్క అత్యంత ఖచ్చితమైన స్పాటియోటెంపోరల్ మ్యాపింగ్ జీవసంబంధ మార్గాలను, వ్యాధి పాథాలజీని అర్థంచేసుకోవడానికి మరియు చికిత్సా ప్రయోజనాల కోసం ఈ పరస్పర చర్యలకు అంతరాయం కలిగించడానికి పరమాణు ఆధారాన్ని అందిస్తుంది.ఈ క్రమంలో, జీవ కణాలు లేదా కణజాలాలలో తాత్కాలిక పరస్పర చర్యలను గుర్తించగల పద్ధతులు చాలా అవసరం.అఫినిటీ ప్యూరిఫికేషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (AP-MS) చారిత్రాత్మకంగా ఆసక్తి గల ప్రోటీన్‌ల (POIలు) బైండింగ్ భాగస్వాములను గుర్తించడానికి ఉపయోగించబడింది.క్వాంటిటేటివ్ ప్రోటీమిక్స్ పద్ధతుల అభివృద్ధితో, Bioplex3.0 సృష్టించబడింది, ఇది AP-MS ఆధారంగా ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌ల యొక్క అతిపెద్ద డేటాబేస్.AP-MS చాలా శక్తివంతమైనది అయినప్పటికీ, వర్క్‌ఫ్లో సెల్ లైసిస్ మరియు డైల్యూషన్ దశలు బలహీనమైన మరియు తాత్కాలిక బైండింగ్ ఇంటరాక్షన్‌ల వైపు మొగ్గు చూపుతాయి మరియు లైసిస్‌కు ముందు కంపార్టమెంటలైజేషన్ లేని నకిలీ ఇంటరాక్షన్ జతల వంటి పోస్ట్-లిసిస్ కళాఖండాలను పరిచయం చేస్తాయి.
ఈ సమస్యలను పరిష్కరించడానికి, క్రాస్‌లింకింగ్ సమూహాలతో అసహజ అమైనో ఆమ్లాలు (UAA) మరియు ఎంజైమాటిక్ సమీపంలోని లేబులింగ్ (PL) ప్లాట్‌ఫారమ్‌లు (ఉదా. APEX మరియు BioID)5 అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి.UAA పద్ధతి అనేక సందర్భాల్లో విజయవంతంగా వర్తింపజేయబడినప్పటికీ మరియు ప్రత్యక్ష ప్రోటీన్ సంసంజనాలపై సమాచారాన్ని అందించినప్పటికీ, UAA చొప్పించే సైట్ యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ ఇప్పటికీ అవసరం.మరీ ముఖ్యంగా, ఇది స్టోయికియోమెట్రిక్ లేబులింగ్ పద్ధతి, ఇది లేబులింగ్ ఈవెంట్‌ల ఉత్ప్రేరక రివర్సల్ లేనిది.దీనికి విరుద్ధంగా, BioID పద్ధతి వంటి ఎంజైమాటిక్ PL పద్ధతులు, ఇంజినీరింగ్ చేసిన బయోటిన్ లిగేస్‌ను POI7కి ఫ్యూజ్ చేస్తాయి, ఇది బయోటిన్‌ను రియాక్టివ్ బయోటైనిల్-AMP ఈస్టర్ ఇంటర్మీడియట్‌గా రూపొందించడానికి సక్రియం చేస్తుంది.ఎంజైమ్ ఈ విధంగా ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది మరియు సక్రియం చేయబడిన బయోటిన్ "క్లౌడ్" ను విడుదల చేస్తుంది, ఇది ప్రాక్సిమల్ లైసిన్ అవశేషాలను లేబుల్ చేస్తుంది.అయినప్పటికీ, తగినంత లేబుల్ చేయబడిన సిగ్నల్‌ను పొందేందుకు BioIDకి 12 గంటల కంటే ఎక్కువ సమయం పడుతుంది, ఇది తాత్కాలిక రిజల్యూషన్‌తో దాని వినియోగాన్ని నిరోధిస్తుంది.ఈస్ట్ డిస్‌ప్లే ఆధారంగా నిర్దేశిత పరిణామాన్ని ఉపయోగించి, TurboID మరింత సమర్థవంతంగా ఉండేలా BioID ఆధారంగా రూపొందించబడింది, 10 నిమిషాల్లో బయోటిన్‌తో సమర్థవంతమైన లేబులింగ్‌ను అనుమతిస్తుంది, మరింత డైనమిక్ ప్రక్రియలను అధ్యయనం చేయడానికి అనుమతిస్తుంది.TurboID అత్యంత చురుకైనది మరియు తక్కువ-స్థాయి లేబులింగ్‌కు అంతర్జాత బయోటిన్ స్థాయిలు సరిపోతాయి కాబట్టి, ఎక్సోజనస్ బయోటిన్‌ని జోడించడం ద్వారా అత్యంత మెరుగుపరచబడిన మరియు సమయానుకూలమైన లేబులింగ్ అవసరమైనప్పుడు నేపథ్య లేబులింగ్ సంభావ్య సమస్యగా మారుతుంది.అదనంగా, యాక్టివేట్ చేయబడిన ఈస్టర్లు పేలవంగా రియాక్టివ్‌గా ఉంటాయి (t1/2 ~5 నిమి), ఇది పెద్ద లేబులింగ్ వ్యాసార్థానికి దారి తీస్తుంది, ముఖ్యంగా బయోటిన్ 5తో పొరుగు ప్రోటీన్‌ల సంతృప్తత తర్వాత. మరొక విధానంలో, ఇంజినీర్డ్ ఆస్కార్బేట్ పెరాక్సిడేస్ (అంటే బయోటిన్- ఫినాల్ రాడికల్స్ మరియు ఒక నిమిషం లోపల ప్రోటీన్ లేబులింగ్ అనుమతిస్తుంది9,10. సబ్ సెల్యులార్ ప్రోటీమ్‌లు, మెమ్బ్రేన్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు సైటోసోలిక్ సిగ్నలింగ్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లను గుర్తించడానికి APEX విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది11,12. అయితే, పెరాక్సైడ్‌ల యొక్క అధిక సాంద్రతల అవసరం రెడాక్స్ ప్రోటీన్‌లు లేదా మార్గాలను ప్రభావితం చేస్తుంది, అంతరాయం కలిగిస్తుంది. సెల్యులార్ ప్రక్రియలు.
అందువల్ల, సెల్యులార్ మార్గాలను గణనీయంగా అంతరాయం కలిగించకుండా అధిక ప్రాదేశిక మరియు తాత్కాలిక ఖచ్చితత్వంతో మరింత రియాక్టివ్ లేబుల్-వ్యాసార్థం అణచివేత జాతులను ఉత్పత్తి చేయగల కొత్త పద్ధతి ఇప్పటికే ఉన్న పద్ధతులకు ముఖ్యమైన అదనంగా ఉంటుంది. రియాక్టివ్ జాతులలో, సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ దాని స్వల్ప జీవితకాలం మరియు పరిమిత వ్యాప్తి వ్యాసార్థం (కణాలలో t1/2 <0.6 µs) కారణంగా మన దృష్టిని రేకెత్తించింది. రియాక్టివ్ జాతులలో, సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ దాని స్వల్ప జీవితకాలం మరియు పరిమిత వ్యాప్తి వ్యాసార్థం (కణాలలో t1/2 <0.6 µs) కారణంగా మన దృష్టిని రేకెత్తించింది. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. క్రియాశీల రూపాలలో, సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ దాని స్వల్ప జీవితకాలం మరియు పరిమిత వ్యాప్తి వ్యాసార్థం (కణాలలో t1/2 <0.6 µs) కారణంగా మన దృష్టిని ఆకర్షించింది.在 活性 物质 物质 ， ， 单线 态氧因 其 寿命 短 短 和 扩散 半径) 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). క్రియాశీల రూపాలలో, సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ దాని స్వల్ప జీవితకాలం మరియు పరిమిత వ్యాప్తి వ్యాసార్థం (కణాలలో t1/2 <0.6 μs) కారణంగా మన దృష్టిని ఆకర్షిస్తుంది.సింగిల్‌లెట్ ఆక్సిజన్ యాదృచ్ఛికంగా మెథియోనిన్, టైరోసిన్, హిస్టిడిన్ మరియు ట్రిప్టోఫాన్‌లను ఆక్సీకరణం చేస్తుందని నివేదించబడింది, ఇది అమైన్ లేదా థియోల్ ఆధారిత ప్రోబ్స్‌తో అనుబంధం కోసం 14,15 ధ్రువంగా చేస్తుంది.సబ్ సెల్యులార్ కంపార్ట్‌మెంట్ RNAను లేబుల్ చేయడానికి సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఉపయోగించబడినప్పటికీ, ఎండోజెనస్ POI సామీప్యత గుర్తులను పునర్నిర్మించే వ్యూహాలు అన్వేషించబడలేదు.ఇక్కడ, మేము ఫోటోయాక్టివేషన్-డిపెండెంట్ ప్రాక్సిమిటీ లేబులింగ్ (PDPL) అనే ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను అందజేస్తాము, ఇక్కడ మేము మినీSOG ఫోటోసెన్సిటైజర్‌తో ఫ్యూజ్ చేయబడిన POIలను ప్రకాశవంతం చేయడానికి బ్లూ లైట్‌ని ఉపయోగిస్తాము మరియు సామీప్య అవశేషాలను ఆక్సీకరణం చేయడానికి సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఉత్పత్తిని ప్రేరేపిస్తాము, తర్వాత రసాయన ప్రోబ్‌లను ఆక్సీకరణం చేయడానికి అమైన్-కలిగిన మార్పులు ఇంటర్మీడియట్ జీవన కణాలు..మేము ట్యాగ్ నిర్దిష్టతను పెంచడానికి రసాయన ప్రోబ్‌ల సమూహాన్ని పరీక్షించాము మరియు ఓపెన్ ప్రోటీమిక్స్ వర్క్‌ఫ్లో ఉపయోగించి సవరణ సైట్‌లను గుర్తించాము.TurboIDతో PDPL యొక్క ప్రక్క ప్రక్క పోలిక PDPL యొక్క మరింత నిర్దిష్టమైన మరియు సమగ్రమైన ప్రోటీమిక్ కవరేజీని చూపుతుంది.క్యాన్సర్-సంబంధిత ఎపిజెనెటిక్ రెగ్యులేటరీ ప్రోటీన్ BRD4 మరియు పార్కిన్సన్స్ వ్యాధి-సంబంధిత E3 లిగేస్ పార్కిన్ కోసం సబ్ సెల్యులార్ ప్రోటీమ్ మరియు బైండింగ్ భాగస్వాముల యొక్క సాధారణ ప్రోటీమ్ గుర్తింపు యొక్క ఆర్గానెల్లె-నిర్దిష్ట మార్కర్లకు మేము ఈ విధానాన్ని వర్తింపజేసాము, ఇది ప్రోటీన్ యొక్క తెలిసిన మరియు తెలియని నెట్‌వర్క్ రెండింటినీ ధృవీకరించింది. పరస్పర చర్యలు..పెద్ద ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లలో E3 సబ్‌స్ట్రేట్‌లను గుర్తించే PDPL సామర్థ్యం పరోక్ష బైండర్‌ల గుర్తింపు అవసరమయ్యే పరిస్థితిని సూచిస్తుంది.సర్వవ్యాప్తి-ప్రోటీసోమ్ మధ్యవర్తిత్వం వహించిన రెండు తెలియని పార్కిన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లు సిటులో నిర్ధారించబడ్డాయి.
ఫోటోడైనమిక్ థెరపీ (PDT)19 మరియు క్రోమోఫోర్-సహాయక లేజర్ నిష్క్రియం (CALI)20, దీనిలో ఫోటోసెన్సిటైజర్‌లతో కాంతి వికిరణం సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తుంది, లక్ష్య ప్రోటీన్‌లను నిష్క్రియం చేస్తుంది లేదా కణాల మరణానికి కారణమవుతుంది.సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ అనేది దాదాపు 70 nm సైద్ధాంతిక వ్యాప్తి దూరంతో అత్యంత రియాక్టివ్ పదార్థం కాబట్టి, ఫోటోసెన్సిటైజర్ చుట్టూ ప్రాదేశికంగా పరిమిత ఆక్సీకరణను నియంత్రించవచ్చు.ఈ భావన ఆధారంగా, జీవ కణాలలో ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల దగ్గరి లేబులింగ్‌ను సాధించడానికి సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్‌ను ఉపయోగించాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము.మేము నాలుగు విధులను నెరవేర్చడానికి PDPL కెమోప్రొటోమిక్ విధానాన్ని అభివృద్ధి చేసాము: (1) PL ఎంజైమాటిక్ విధానం వలె క్రియాశీల సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఉత్పత్తిని ఉత్ప్రేరకపరచడానికి;(2) లైట్ దీక్షపై సమయ-పరిష్కార లేబులింగ్ అందించండి;(3) మార్పు ద్వారా (4) బ్యాక్‌గ్రౌండ్‌ని తగ్గించడానికి ఎండోజెనస్ కాఫాక్టర్‌లను (బయోటిన్ వంటివి) ఉపయోగించకుండా ఉండండి లేదా పర్యావరణ ఒత్తిడికి సెల్ ఎక్స్‌పోజర్‌ను తగ్గించడానికి అత్యంత కలతపెట్టే ఎక్సోజనస్ రియాజెంట్‌లను (పెరాక్సైడ్‌లు వంటివి) ఉపయోగించండి.
ఫోటోసెన్సిటైజర్‌లను చిన్న మాలిక్యులర్ వెయిట్ ఫ్లోరోఫోర్స్ (ఉదా. రోజ్ బెంగాల్, మిథైలీన్ బ్లూ) 22 మరియు జన్యుపరంగా ఎన్‌కోడ్ చేసిన చిన్న ప్రోటీన్‌లు (ఉదా. మినీఎస్‌ఓజి, కిల్లర్‌రెడ్)23తో సహా రెండు వర్గాలుగా విభజించవచ్చు.మాడ్యులర్ డిజైన్‌ను సాధించడానికి, మేము POI24,25 (Figure 1a)కి ఫోటోసెన్సిటైజర్ (PS) ప్రోటీన్‌లను జోడించడం ద్వారా మొదటి తరం PDPL ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను అభివృద్ధి చేసాము.నీలి కాంతితో వికిరణం చేసినప్పుడు, సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ప్రాక్సిమల్ న్యూక్లియోఫిలిక్ అమైనో యాసిడ్ అవశేషాలను ఆక్సీకరణం చేస్తుంది, దీని ఫలితంగా ఎలెక్ట్రోఫిలిక్ మరియు అమైన్ ప్రోబ్ న్యూక్లియోఫైల్స్‌తో మరింత ప్రతిస్పందించగల అంపోలంగ్ ధ్రువణత ఏర్పడుతుంది.క్లిక్ కెమిస్ట్రీని అనుమతించడానికి మరియు LC/MS/MS క్యారెక్టరైజేషన్ కోసం క్రిందికి లాగడానికి ప్రోబ్ ఆల్కైన్ హ్యాండిల్‌తో రూపొందించబడింది.
miniSOG మధ్యవర్తిత్వం వహించిన ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల లేబులింగ్ యొక్క స్కీమాటిక్ ఇలస్ట్రేషన్.నీలి కాంతికి గురైనప్పుడు, miniSOG-POIని వ్యక్తీకరించే కణాలు సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తాయి, ఇది ఇంటరాక్టింగ్ ప్రోటీన్‌లను మారుస్తుంది కానీ నాన్-బైండింగ్ ప్రోటీన్‌లను కాదు.ఫోటోఆక్సిడేషన్ యొక్క ఇంటర్మీడియట్ ఉత్పత్తులు సమయోజనీయ వ్యసనాలను ఏర్పరచడానికి అమైన్ రసాయన ప్రోబ్ యొక్క రిలే లేబుల్‌ల ద్వారా అడ్డగించబడతాయి.కెమిస్ట్రీ ప్రోబ్‌లోని ఆల్కైనైల్ సమూహం LC-MS/MS పరిమాణాన్ని అనుసరించి పుల్-డౌన్ ద్వారా సుసంపన్నం కోసం క్లిక్ కెమిస్ట్రీని అనుమతిస్తుంది.b అమైన్ ప్రోబ్స్ యొక్క రసాయన నిర్మాణం 1-4.c మైటోకాన్డ్రియల్ స్థానికీకరించిన miniSOG-మధ్యవర్తిత్వ ప్రోటీమిక్ మార్కర్ల యొక్క ప్రతినిధి ఫ్లోరోసెంట్ జెల్ విశ్లేషణ ప్రోబ్స్ 1-4 మరియు జెల్ డెన్సిటోమెట్రీ ఆధారంగా సాపేక్ష పరిమాణాన్ని ఉపయోగించి.రసాయన ప్రోబ్స్ యొక్క సిగ్నల్-టు-బ్యాక్‌గ్రౌండ్ నిష్పత్తి నీలి కాంతిని మినహాయించి ప్రతికూల నియంత్రణ ప్రయోగాలను ఉపయోగించి లేదా miniSOG వ్యక్తీకరణ లేకుండా HEK293T కణాలను ఉపయోగించి అంచనా వేయబడింది.n = 2 జీవశాస్త్ర స్వతంత్ర నమూనాలు.ప్రతి చుక్క ఒక జీవ ప్రతిరూపాన్ని సూచిస్తుంది.d సూచించిన PDPL భాగాల సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో ఆప్టిమైజ్ చేసిన ప్రోబ్ 3ని ఉపయోగించి PDPL యొక్క ప్రతినిధి గుర్తింపు మరియు పరిమాణీకరణ c.n = 3 జీవశాస్త్ర స్వతంత్ర నమూనాలు.ప్రతి చుక్క ఒక జీవ ప్రతిరూపాన్ని సూచిస్తుంది.మధ్యరేఖలు మరియు మీసాలు సగటు మరియు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.CBB: కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ.ఇ ఫార్-రెడ్ Si-DMA స్టెయిన్‌తో సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ యొక్క కన్ఫోకల్ ఇమేజింగ్.స్కేల్ బార్: 10 µm.జెల్ ఇమేజింగ్ మరియు కాన్ఫోకల్ ప్రయోగాలు సారూప్య ఫలితాలతో కనీసం రెండుసార్లు స్వతంత్రంగా పునరావృతమయ్యాయి.
రసాయన ప్రోబ్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1a) వలె ప్రోటీమ్ యొక్క ప్రొపార్గిలమైన్ లేబులింగ్‌ను మధ్యవర్తిత్వం చేయడానికి HEK293Tలో స్థిరంగా వ్యక్తీకరించబడిన పరిపక్వ ఫోటోసెన్సిటైజర్‌లు miniSOG26 మరియు KillerRed23 సామర్థ్యాన్ని మేము మొదట పరీక్షించాము.జెల్ ఫ్లోరోసెన్స్ విశ్లేషణ miniSOG మరియు బ్లూ లైట్ రేడియేషన్ ఉపయోగించి మొత్తం ప్రోటీమ్ లేబులింగ్ సాధించబడిందని చూపించింది, అయితే కిల్లర్‌రెడ్‌తో కనిపించే లేబులింగ్ ఉత్పత్తి గమనించబడలేదు.సిగ్నల్-టు-బ్యాక్‌గ్రౌండ్ నిష్పత్తిని మెరుగుపరచడానికి, మేము అనిలిన్ (1 మరియు 3), ప్రొపైలమైన్ (2) లేదా బెంజిలమైన్ (4) కలిగిన రసాయన ప్రోబ్‌ల సమితిని పరీక్షించాము.HEK293T సెల్‌లు బ్లూ లైట్‌తో పోలిస్తే అధిక బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సిగ్నల్‌ను కలిగి ఉన్నాయని మేము గమనించాము, బహుశా ఎండోజెనస్ రిబోఫ్లావిన్ ఫోటోసెన్సిటైజర్, ఫ్లావిన్ మోనోన్యూక్లియోటైడ్ (FMN) 27 కారణంగా. అనిలిన్-ఆధారిత రసాయన ప్రోబ్స్ 1 మరియు 3 మెరుగైన విశిష్టతను అందించాయి, మైటోకాండ్రియాలో HEK293T స్థిరంగా miniSOGని వ్యక్తీకరిస్తుంది, ప్రోబ్ 3 కోసం సిగ్నల్‌లో 8 రెట్లు పెరుగుదలను ప్రదర్శిస్తుంది, అయితే RNA-లేబులింగ్ పద్ధతిలో CAP-seq ఉపయోగించిన ప్రోబ్ 2 ~2.5-ని మాత్రమే ప్రదర్శిస్తుంది. రెట్లు సిగ్నల్ పెరుగుదల, RNA మరియు ప్రొటీన్‌ల మధ్య వివిధ రియాక్టివిటీ ప్రాధాన్యతల వల్ల కావచ్చు (Fig. 1b, c). అనిలిన్-ఆధారిత రసాయన ప్రోబ్స్ 1 మరియు 3 మెరుగైన విశిష్టతను అందించాయి, మైటోకాండ్రియాలో HEK293T స్థిరంగా miniSOGని వ్యక్తీకరిస్తుంది, ప్రోబ్ 3 కోసం సిగ్నల్‌లో 8 రెట్లు పెరుగుదలను ప్రదర్శిస్తుంది, అయితే RNA-లేబులింగ్ పద్ధతిలో CAP-seq ఉపయోగించిన ప్రోబ్ 2 ~2.5-ని మాత్రమే ప్రదర్శిస్తుంది. రెట్లు సిగ్నల్ పెరుగుదల, RNA మరియు ప్రొటీన్‌ల మధ్య వివిధ రియాక్టివిటీ ప్రాధాన్యతల వల్ల కావచ్చు (Fig. 1b, c).అనిలిన్-ఆధారిత రసాయన ప్రోబ్స్ 1 మరియు 3 మెరుగైన విశిష్టతను చూపించాయి: మైటోకాండ్రియాలో miniSOGని స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే HEK293T, ప్రోబ్ 3 కోసం సిగ్నల్‌లో 8 రెట్లు ఎక్కువ పెరుగుదలను చూపుతుంది, అయితే ప్రోబ్ 2, CAP-seq RNA లేబులింగ్ పద్ధతిలో ఉపయోగించబడింది, మాత్రమే ~2.5 రెట్లు సిగ్నల్ పెరుగుదలను చూపుతుంది, బహుశా RNA మరియు ప్రొటీన్‌ల మధ్య వివిధ రియాక్టివిటీ ప్రాధాన్యతల కారణంగా (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 好 的 的 ， ， ， ， ， 线 线 粒体 中 表达 表达 మినిసోగ్ ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， ， 而 而 于 于 于2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b, c）。基于 苯胺 的 化学 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 的 特异性 ， ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 表达 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAఅనిలిన్-ఆధారిత రసాయన ప్రోబ్స్ 1 మరియు 3 మెరుగైన విశిష్టతను కలిగి ఉన్నాయి, మైటోకాండ్రియాలో HEK293T స్థిరంగా వ్యక్తీకరించబడిన miniSOG, మరియు ప్రోబ్ 3 సిగ్నల్‌లో 8 రెట్లు పెరుగుదలను కలిగి ఉంది, అయితే CAP-seq RNA లేబులింగ్ పద్ధతి కోసం ప్రోబ్ 2 ~2.5 రెట్లు మాత్రమే పెరిగింది.సిగ్నల్‌లో, బహుశా RNA మరియు ప్రోటీన్ (Fig. 1b, c) మధ్య విభిన్న ప్రతిచర్య ప్రాధాన్యతల వల్ల కావచ్చు.అదనంగా, ప్రోబ్ 3 ఐసోమర్‌లు మరియు హైడ్రాజైన్ ప్రోబ్స్ (ప్రోబ్స్ 5, 6, 7) పరీక్షించబడ్డాయి, ఇది ప్రోబ్ 3 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1 బి, సి) యొక్క ఆప్టిమైజేషన్‌ను నిర్ధారిస్తుంది.అదేవిధంగా, ఇన్-జెల్ ఫ్లోరోసెన్స్ విశ్లేషణ ఇతర ఆప్టిమైజ్ చేసిన ప్రయోగాత్మక పారామితులను వెల్లడించింది: రేడియేషన్ తరంగదైర్ఘ్యం (460 nm), కెమికల్ ప్రోబ్ ఏకాగ్రత (1 mM), మరియు రేడియేషన్ సమయం (20 నిమి) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2a-c).PDPL ప్రోటోకాల్‌లో ఏదైనా భాగం లేదా దశను వదిలివేయడం వలన నేపథ్యానికి గణనీయమైన సిగ్నల్ రివర్సల్ ఏర్పడింది (Fig. 1d).ముఖ్యంగా, సోడియం అజైడ్ లేదా ట్రోలాక్స్ సమక్షంలో ప్రోటీన్ లేబులింగ్ గణనీయంగా తగ్గింది, ఇవి సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్‌ను అణచివేస్తాయి.సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్‌ను స్థిరీకరించడానికి తెలిసిన D2O ఉనికి, లేబులింగ్ సిగ్నల్‌ను మెరుగుపరుస్తుంది.లేబులింగ్‌కు ఇతర రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతుల సహకారాన్ని పరిశోధించడానికి, హైడ్రాక్సిల్ మరియు సూపర్ ఆక్సైడ్ రాడికల్ స్కావెంజర్‌లను స్థాపించడానికి మన్నిటాల్ మరియు విటమిన్ సి వరుసగా 18, 29 జోడించబడ్డాయి, అయితే అవి లేబులింగ్‌ను తగ్గించడానికి కనుగొనబడలేదు.H2O2ని జోడించడం, కానీ ప్రకాశం కాదు, లేబులింగ్‌కు దారితీయలేదు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3a).Si-DMA ప్రోబ్స్‌తో కూడిన ఫ్లోరోసెన్స్ సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఇమేజింగ్ HEK293T-miniSOG వైర్‌లో సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఉనికిని నిర్ధారించింది, కానీ అసలు HEK293T వైర్‌లో కాదు.అదనంగా, mitoSOX Red ప్రకాశం తర్వాత సూపర్ ఆక్సైడ్ ఉత్పత్తిని గుర్తించలేకపోయింది (Fig. 1e మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3b) 30. సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ తదుపరి ప్రోటీమిక్ లేబులింగ్‌కు బాధ్యత వహించే ప్రధాన రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతులు అని ఈ డేటా గట్టిగా సూచిస్తుంది.PDPL యొక్క సైటోటాక్సిసిటీ బ్లూ లైట్ రేడియేషన్ మరియు కెమికల్ ప్రోబ్స్‌తో సహా అంచనా వేయబడింది మరియు ముఖ్యమైన సైటోటాక్సిసిటీ గమనించబడలేదు (అనుబంధ Fig. 4a).
లేబులింగ్ మెకానిజంను అధ్యయనం చేయడానికి మరియు LC-MS/MS ఉపయోగించి ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క ప్రోటీమిక్ గుర్తింపును ప్రారంభించడానికి, మేము ముందుగా ఏ అమైనో ఆమ్లాలు సవరించబడ్డాయో మరియు ప్రోబ్ లేబుల్‌ల డెల్టా ద్రవ్యరాశిని గుర్తించాలి.మెథియోనిన్, హిస్టిడిన్, ట్రిప్టోఫాన్ మరియు టైరోసిన్ సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ 14,15 ద్వారా సవరించబడినట్లు నివేదించబడింది.మేము MSFragger32 ఆధారంగా FragPipe కంప్యూటింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్ అందించిన నిష్పాక్షికమైన ఓపెన్ సెర్చ్‌తో TOP-ABPP31 వర్క్‌ఫ్లోను ఏకీకృతం చేస్తాము.సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ సవరణ మరియు రసాయన ప్రోబ్ లేబులింగ్ తర్వాత, క్లీవబుల్ లింకర్‌ను కలిగి ఉన్న బయోటిన్ తగ్గింపు లేబుల్‌ని ఉపయోగించి క్లిక్ కెమిస్ట్రీ నిర్వహించబడింది, తర్వాత న్యూట్రావిడిన్ స్ట్రెచింగ్ మరియు ట్రిప్సిన్ జీర్ణక్రియ జరిగింది.సవరించిన పెప్టైడ్, ఇప్పటికీ రెసిన్‌కు కట్టుబడి ఉంది, LC-MS/MS విశ్లేషణ కోసం ఫోటోక్లీవ్ చేయబడింది (మూర్తి 2a మరియు అనుబంధ డేటా 1).50 కంటే ఎక్కువ పెప్టైడ్ మ్యాప్ (PSM) సరిపోలికలతో ప్రోటీమ్ అంతటా పెద్ద సంఖ్యలో మార్పులు జరిగాయి (Fig. 2b).ఆశ్చర్యకరంగా, మేము హిస్టిడిన్ యొక్క మార్పును మాత్రమే గమనించాము, బహుశా ఇతర అమైనో ఆమ్లాల కంటే అనిలిన్ ప్రోబ్స్ వైపు ఆక్సిడైజ్ చేయబడిన హిస్టిడిన్ యొక్క అధిక రియాక్టివిటీ కారణంగా.సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ద్వారా హిస్టిడిన్ ఆక్సీకరణ యొక్క ప్రచురించిన విధానం ప్రకారం, 21,33 ప్రతిపాదిత డెల్టా-మాస్ నిర్మాణం +229 డా రెండు ఆక్సీకరణల తర్వాత 2-ఆక్సో-హిస్టిడిన్‌తో ప్రోబ్ 3 యొక్క వ్యసనానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది, అయితే +247 డా అనేది జలవిశ్లేషణ ఉత్పత్తి. యొక్క +229 డా (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5).MS2 స్పెక్ట్రమ్ యొక్క మూల్యాంకనం చాలా వరకు y మరియు b అయాన్ల గుర్తింపు యొక్క అధిక విశ్వసనీయతను చూపించింది, సవరించిన ఫ్రాగ్మెంట్ అయాన్ల (y మరియు b) (Fig. 2c) గుర్తింపుతో సహా.PDPL-మార్పు చేయబడిన హిస్టిడైన్‌ల యొక్క స్థానిక శ్రేణి యొక్క సందర్భ విశ్లేషణ ±1 స్థానాల్లో (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4b) చిన్న హైడ్రోఫోబిక్ అవశేషాల కోసం మోడరేట్ మోటిఫ్ ప్రాధాన్యతను వెల్లడించింది.సగటున, ప్రతి ప్రోటీన్‌కు 1.4 హిస్టిడైన్‌లు గుర్తించబడ్డాయి మరియు ఈ మార్కర్‌ల సైట్‌లు ద్రావకం యాక్సెస్ చేయగల ఉపరితల వైశాల్యం (SASA) మరియు సాపేక్ష ద్రావణి లభ్యత (RSA) విశ్లేషణ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4c,d) ద్వారా నిర్ణయించబడతాయి.
MSFragger ద్వారా ఆధారితమైన FragPipe కంప్యూటింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను ఉపయోగించి అవశేష ఎంపికను అధ్యయనం చేయడానికి నిష్పాక్షికమైన వర్క్‌ఫ్లో.స్ట్రెప్టావిడిన్ రెసిన్ నుండి సవరించిన పెప్టైడ్‌ల ఫోటోక్లీవేజ్‌ను అనుమతించడానికి క్లిక్ కెమిస్ట్రీలో క్లీవబుల్ లింకర్లు ఉపయోగించబడతాయి.అనేక మార్పులను, అలాగే సంబంధిత అవశేషాలను గుర్తించడానికి బహిరంగ శోధన ప్రారంభించబడింది.b ప్రోటీమ్ అంతటా సంభవించే మార్పుల ద్రవ్యరాశిని కేటాయించండి.పెప్టైడ్ మ్యాపింగ్ PSM.ప్రోబ్ 3తో సవరించబడిన హిస్టిడిన్ సైట్‌ల యొక్క c MS2 స్పెక్ట్రల్ ఉల్లేఖనం. ఒక ప్రతినిధి ఉదాహరణగా, ప్రోబ్ 3తో సమయోజనీయ ప్రతిచర్య సవరించిన అమైనో ఆమ్లానికి +229.0938 డా జోడించబడింది.d PDPL మార్కర్ల కోసం పరీక్షించడానికి ఉపయోగించే మ్యుటేషన్ అస్సే.PRDX3 (H155A, H225A) మరియు PRDX1 (H10A, H81A, H169A) యాంటీ-ఫ్లాగ్ డిటెక్షన్ కోసం వైల్డ్-టైప్ ప్లాస్మిడ్‌లతో బదిలీ చేయబడ్డాయి.e సింథటిక్ పెప్టైడ్ ప్రోబ్ 3 సమక్షంలో శుద్ధి చేయబడిన miniSOGతో స్పందించబడింది మరియు LC-MS స్పెక్ట్రమ్‌లో Δm +247 మరియు +229తో సంబంధిత ఉత్పత్తులు గుర్తించబడ్డాయి.f ఇన్ విట్రో ప్రోటీన్-టు-ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్‌లు miniSOG-6xHis-tag మరియు anti-6xHis యాంటీబాడీతో రూపొందించబడ్డాయి.యాంటీబయోటిన్ (స్ట్రెప్టావిడిన్-HRP) మరియు miniSOG-6xHis/anti-6xHis యాంటీబాడీ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క యాంటీ-మౌస్ వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ, కాంతికి బహిర్గతమయ్యే సమయాన్ని బట్టి ప్రోబ్ 3తో లేబుల్ చేయబడింది.వ్యక్తిగత ప్రోటీన్ల కోసం లేబుల్‌లు సంబంధిత పరమాణు బరువులో వ్యక్తీకరించబడతాయి: LC యాంటీబాడీ లైట్ చైన్, HC యాంటీబాడీ హెవీ చైన్.ఈ ప్రయోగాలు సారూప్య ఫలితాలతో కనీసం రెండుసార్లు స్వతంత్రంగా పునరావృతమయ్యాయి.
లేబులింగ్ సైట్ యొక్క జీవరసాయన ధృవీకరణ కోసం, మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ద్వారా గుర్తించబడిన PRDX3 మరియు PRDX1 హిస్టిడిన్ నుండి అలనైన్‌కు మార్చబడ్డాయి మరియు బదిలీ పరీక్షలలో వైల్డ్ రకంతో పోల్చబడ్డాయి.మ్యుటేషన్ లేబులింగ్‌ను గణనీయంగా తగ్గించిందని PDPL ఫలితాలు చూపించాయి (Fig. 2d).ఇంతలో, ఓపెన్ సెర్చ్‌లో గుర్తించబడిన పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లు ప్రోబ్ 3 మరియు బ్లూ లైట్ సమక్షంలో శుద్ధి చేయబడిన miniSOGతో విట్రోలో సంశ్లేషణ చేయబడ్డాయి మరియు ప్రతిస్పందించబడ్డాయి, LC-MS ద్వారా గుర్తించబడినప్పుడు +247 మరియు +229 Da యొక్క మాస్ షిఫ్ట్‌తో ఉత్పత్తులను అందిస్తుంది (Fig. . 2e).)miniSOG ఫోటోయాక్టివేషన్‌కు ప్రతిస్పందనగా ఇంటరాక్టింగ్ ప్రాక్సిమల్ ప్రోటీన్‌లను విట్రోలో లేబుల్ చేయవచ్చో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము miniSOG-6xHis ప్రోటీన్ మరియు యాంటీ-హిస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ ఇన్ విట్రో (Figure 2f) మధ్య పరస్పర చర్య ద్వారా కృత్రిమ సామీప్యత పరీక్షను రూపొందించాము.ఈ పరీక్షలో, miniSOGతో యాంటీబాడీ హెవీ మరియు లైట్ చైన్‌ల యొక్క ప్రాక్సిమల్ లేబులింగ్‌ని మేము ఆశించాము.వాస్తవానికి, యాంటీ-మౌస్ (యాంటీ-6xహిస్-లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీ యొక్క భారీ మరియు తేలికపాటి గొలుసులను గుర్తించడం) మరియు స్ట్రెప్టావిడిన్ వెస్ట్రన్ బ్లాట్‌లు భారీ మరియు తేలికపాటి గొలుసుల యొక్క బలమైన బయోటైనిలేషన్‌ను చూపించాయి.ముఖ్యంగా, మేము 6xHis ట్యాగ్ మరియు కాంతి మరియు భారీ గొలుసుల మధ్య క్రాస్-లింక్‌ల కారణంగా miniSOG ఆటోబయోటినిలేషన్‌ను గమనించాము, ఇది లైసిన్ మరియు 2-ఆక్సో-హిస్టిడిన్ ప్రాక్సిమల్ ప్రతిస్పందన మధ్య గతంలో వివరించిన అంతరానికి సంబంధించినది కావచ్చు.ముగింపులో, PDPL హిస్టిడిన్‌ను సామీప్య ఆధారిత పద్ధతిలో సవరించిందని మేము నిర్ధారించాము.
ఇన్ సిటు లేబులింగ్ యొక్క విశిష్టతను పరీక్షించడానికి ఉపకణ ప్రోటీమ్‌ను వర్గీకరించడం మా తదుపరి లక్ష్యం.అందువల్ల, మేము HEK293T కణాల న్యూక్లియస్, మైటోకాన్డ్రియల్ మాతృక లేదా బయటి ER పొరలో miniSOGని స్థిరంగా వ్యక్తీకరించాము (Fig. 3a).జెల్ ఫ్లోరోసెన్స్ విశ్లేషణ మూడు ఉపకణ స్థానాల్లో సమృద్ధిగా లేబుల్ చేయబడిన బ్యాండ్‌లను అలాగే విభిన్న లేబులింగ్ నమూనాలను వెల్లడించింది (Fig. 3b).ఫ్లోరోసెన్స్ ఇమేజింగ్ విశ్లేషణ PDPL (Fig. 3c) యొక్క అధిక విశిష్టతను చూపించింది.PDPL వర్క్‌ఫ్లో ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి సబ్ సెల్యులార్ ప్రోటీమ్‌లను వివరించడానికి రోడమైన్ డైస్‌తో క్లిక్ రియాక్షన్‌లను అనుసరించింది మరియు PDPL సిగ్నల్‌లు DAPI, మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాకర్స్ లేదా ER ట్రాకర్‌లతో కలకలైజ్ చేయబడ్డాయి, ఇది PDPL యొక్క అధిక విశ్వసనీయతను నిర్ధారిస్తుంది.మూడు ఆర్గానెల్ స్థానాల కోసం, అవిడిన్ వెస్ట్రన్ బ్లాట్‌ను ఉపయోగించి టర్బోఐడితో PDPL యొక్క ప్రక్క ప్రక్క పోలిక వారి సంబంధిత నియంత్రణలతో పోల్చితే PDPL మరింత ప్రత్యేకంగా లేబుల్ చేయబడిందని చూపించింది.PDPL పరిస్థితులలో, మరిన్ని లేబుల్ బ్యాండ్‌లు కనిపించాయి, ఇది మరింత PDPL-లేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తుంది (అనుబంధ Fig. 6a-d).
miniSOG-మెడియేటెడ్ ఆర్గానెల్లె-నిర్దిష్ట ప్రోటీమ్ లేబులింగ్ యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం.miniSOG మానవ COX4 (mito-miniSOG) యొక్క N-టెర్మినల్ 23 అమైనో ఆమ్లాలకు ఫ్యూజన్ ద్వారా మైటోకాన్డ్రియల్ మాతృకను లక్ష్యంగా చేసుకుంటుంది, న్యూక్లియస్ H2B (న్యూక్లియస్-miniSOG)కి ఫ్యూజన్ ద్వారా మరియు Sec61β ER పొర యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ వైపు ద్వారా (ER-miniSOG) )సూచనలలో జెల్ ఇమేజింగ్, కాన్ఫోకల్ ఇమేజింగ్ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ఉన్నాయి.b మూడు ఆర్గానెల్లె-నిర్దిష్ట PDPL ప్రొఫైల్‌ల ప్రతినిధి జెల్ చిత్రాలు.CBB కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ.c V5 (ఎరుపు) అని లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీ ద్వారా కనుగొనబడిన వివిధ ఉపకణ స్థానికీకరణలతో మినీSOGని స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే HEK293T కణాల ప్రతినిధి కన్ఫోకల్ చిత్రాలు.మైటోకాండ్రియా మరియు ER (ఆకుపచ్చ) కోసం ఉపకణ గుర్తులను ఉపయోగిస్తారు.PDPL వర్క్‌ఫ్లో Cy3-azide క్లిక్ కెమిస్ట్రీని ఉపయోగించి miniSOG (పసుపు) లేబుల్ చేయబడిన ఉపకణ ప్రోటీమ్‌ల గుర్తింపును కలిగి ఉంటుంది.స్కేల్ బార్: 10 µm.d లేబుల్ చేయని పరిమాణీకరణ (n = 3 స్వతంత్ర జీవ ప్రయోగాలు) ద్వారా లెక్కించబడిన వివిధ అవయవాలలో PDPL-ట్యాగ్ చేయబడిన ప్రోటీమ్‌ల అగ్నిపర్వత ప్లాట్లు.అగ్నిపర్వత ప్లాట్లపై టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ ఉపయోగించబడింది.HEK293T వైల్డ్ రకం ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది. గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత వ్యత్యాసం). గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత వ్యత్యాసం). Значительно измененные белки выделены krasnыm цветом (p <0,05 и >2-క్రాట్నాయ రజనీసా వినియోన్స్). గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు > అయాన్ తీవ్రతలో 2 రెట్లు వ్యత్యాసం).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены krasным цветом (p <0,05 и > 2-క్రాట్నాయ రజనీష మరియు ионной силе). గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు > అయానిక్ బలంలో 2 రెట్లు వ్యత్యాసం).HEK293T-miniSOGకి ముఖ్యమైన సంబంధిత ప్రోటీన్లు కానీ HEK293Tకి ముఖ్యమైనవి కావు.ఇ ప్రయోగాల నుండి ప్రోటీమిక్ డేటాసెట్‌ల విశిష్టత యొక్క విశ్లేషణ డి.ప్రతి అవయవంలో (ఎరుపు మరియు ఆకుపచ్చ చుక్కలు) గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన మొత్తం ప్రోటీన్ల సంఖ్య ఎగువన గుర్తించబడింది.హిస్టోగ్రామ్‌లు మిటోకార్టా 3.0, GO విశ్లేషణ మరియు A. టింగ్ మరియు ఇతరులపై ఆధారపడిన ఆర్గానిల్స్‌లో స్థానికీకరించబడిన ప్రోటీన్‌లను చూపుతాయి.ప్రజలు.మైటోకాండ్రియా, న్యూక్లియై మరియు ER కోసం ప్రత్యేక డేటాసెట్‌లు.ఈ ప్రయోగాలు సారూప్య ఫలితాలతో కనీసం రెండుసార్లు స్వతంత్రంగా పునరావృతమయ్యాయి.ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.
జెల్ మరియు ఇమేజింగ్ ఫలితాల ద్వారా ప్రోత్సహించబడి, ప్రతి అవయవంలో (సప్లిమెంటరీ డేటా 2) గుర్తించబడిన ప్రోటీమ్‌ను లెక్కించడానికి లేబుల్-రహిత పరిమాణీకరణ ఉపయోగించబడింది.నేపథ్య మార్కర్‌లను తీసివేయడానికి బదిలీ చేయని HEK293T ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది. అగ్నిపర్వతం ప్లాట్ విశ్లేషణ గణనీయంగా సుసంపన్నమైన ప్రోటీన్‌లను (p <0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత) అలాగే miniSOG-ఎక్స్‌ప్రెస్సింగ్ లైన్‌లలో మాత్రమే ఉండే సింగిల్‌టన్ ప్రోటీన్‌లను ప్రదర్శించింది (Fig. 3d ఎరుపు మరియు ఆకుపచ్చ చుక్కలు). అగ్నిపర్వతం ప్లాట్ విశ్లేషణ గణనీయంగా సుసంపన్నమైన ప్రోటీన్‌లను (p <0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత) అలాగే miniSOG-ఎక్స్‌ప్రెస్సింగ్ లైన్‌లలో మాత్రమే ఉండే సింగిల్‌టన్ ప్రోటీన్‌లను ప్రదర్శించింది (Fig. 3d ఎరుపు మరియు ఆకుపచ్చ చుక్కలు). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). అగ్నిపర్వతం ప్లాట్ విశ్లేషణ గణనీయంగా సుసంపన్నమైన ప్రోటీన్‌లను (p<0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత) అలాగే miniSOG-ఎక్స్‌ప్రెస్సింగ్ లైన్‌లలో మాత్రమే ఉండే సింగిల్ ప్రోటీన్‌లను చూపించింది (Fig. 3d, ఎరుపు మరియు ఆకుపచ్చ చుక్కలు).火山图 分析 分析 显示 显着 显着 富集 的 蛋白质 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 倍 离子 强度 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 单一 （图 图 3d 红色 和））。。。。。。。。。。。火山图 分析 显示 显示 出 显着 显着 的 蛋白质 蛋白质 p <0.05 和> 2 倍 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 在于 在于 表达 系 的 单一 蛋白质 图 图 3d 红色 绿色点 绿色点 。。。）））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). అగ్నిపర్వతం ప్లాట్ విశ్లేషణ గణనీయంగా సుసంపన్నమైన ప్రోటీన్‌లను (p<0.05 మరియు >2x అయానిక్ బలం) అలాగే miniSOG వ్యక్తీకరణ లైన్‌లో మాత్రమే ఉన్న ఒకే ప్రోటీన్‌లను వెల్లడించింది (Fig. 3dలో ఎరుపు మరియు ఆకుపచ్చ చుక్కలు).ఈ డేటాను కలిపి, మేము వరుసగా 1364, 461 మరియు 911 గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన అణు, మైటోకాన్డ్రియల్ మరియు ER బాహ్య పొర ప్రోటీన్‌లను గుర్తించాము.ఆర్గానెల్లె-లోకలైజ్డ్ PDPL యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని విశ్లేషించడానికి, మేము MitoCarta 3.0, జీన్ ఒంటాలజీ (GO) విశ్లేషణ మరియు A. టింగ్ మరియు ఇతరులను ఉపయోగించాము.73.4, 78.5 మరియు 73.0% (Fig. 3e) యొక్క ఖచ్చితత్వానికి అనుగుణంగా కనుగొనబడిన ప్రోటీన్‌ల యొక్క అవయవ విశిష్టతను పరీక్షించడానికి మైటోకాండ్రియా, న్యూక్లియస్ మరియు ER కోసం డేటా సెట్8 ఉపయోగించబడింది.PDPL యొక్క విశిష్టత, ఆర్గానెల్లె-నిర్దిష్ట ప్రోటీమ్‌లను గుర్తించడానికి PDPL ఒక ఆదర్శవంతమైన సాధనం అని నిర్ధారిస్తుంది.ముఖ్యంగా, గుర్తించబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క సబ్‌మిటోకాన్డ్రియల్ విశ్లేషణ, చిక్కుకున్న ప్రోటీమ్ ప్రధానంగా మాతృక మరియు లోపలి పొరలో (వరుసగా 226 మరియు 106) పంపిణీ చేయబడిందని, మొత్తం గుర్తించబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్‌లలో 91.7% (362) వాటాను కలిగి ఉందని తేలింది.PDPL యొక్క అధిక స్థాయి అదనంగా నిర్ధారించబడింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7a).అదేవిధంగా, సబ్‌న్యూక్లియర్ విశ్లేషణలో సంగ్రహించబడిన ప్రోటీమ్ ప్రధానంగా న్యూక్లియస్, న్యూక్లియోప్లాజమ్ మరియు న్యూక్లియోలస్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7 బి)లో పంపిణీ చేయబడిందని చూపించింది.న్యూక్లియర్ లోకలైజేషన్ సిగ్నల్ పెప్టైడ్ (3xNLS)తో న్యూక్లియర్ ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ H2B నిర్మాణం (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7c-h)కి సమానమైన ఖచ్చితత్వాన్ని చూపింది.PDPL మార్కర్ యొక్క విశిష్టతను గుర్తించడానికి, న్యూక్లియర్ లామినిన్ A మరింత వివిక్తంగా స్థానికీకరించబడిన POI7 ట్రాప్‌గా ఎంపిక చేయబడింది.PDPL గణనీయంగా సుసంపన్నమైన 36 ప్రోటీన్‌లను గుర్తించింది, వీటిలో 12 ప్రోటీన్‌లు (లామిన్ Aతో సహా 30.0%) స్ట్రింగ్ డేటాబేస్ ద్వారా ఉల్లేఖించబడిన లామిన్ ఎ ఇంటరాక్టింగ్ ప్రోటీన్‌లు, బయోఐడి పద్ధతి కంటే ఎక్కువ శాతం (122 ప్రోటీన్లు) 28లో 28. , 22.9. %) 7. మా పద్ధతి తక్కువ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించింది, బహుశా పరిమిత లేబులింగ్ ప్రాంతాల కారణంగా, ఇది మరింత చురుకైన సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ద్వారా సాధ్యమైంది.గుర్తించబడిన ప్రోటీన్లు ప్రధానంగా న్యూక్లియోప్లాజమ్ (26), న్యూక్లియర్ మెమ్బ్రేన్ (10), న్యూక్లియర్ మెమ్బ్రేన్ (9) మరియు న్యూక్లియర్ పోర్స్ (5)లో ఉన్నాయని GO విశ్లేషణ చూపించింది.సమిష్టిగా, ఈ న్యూక్లియర్-లోకలైజ్డ్ ప్రొటీన్‌లు 80% సుసంపన్నమైన ప్రోటీన్‌లను కలిగి ఉన్నాయి, ఇది PDPL (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8a-d) యొక్క విశిష్టతను మరింతగా ప్రదర్శిస్తుంది.
ఆర్గానిల్స్‌లో సామీప్య మార్కింగ్ చేయడానికి PDPL సామర్థ్యాన్ని స్థాపించిన తర్వాత, POI బైండింగ్ భాగస్వాములను విశ్లేషించడానికి PDPL ఉపయోగించవచ్చా అని మేము పరీక్షించాము.ప్రత్యేకించి, సైటోసోలిక్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క PDPL విశ్లేషణను నిర్వచించడానికి మేము ప్రయత్నించాము, ఇవి వాటి అత్యంత డైనమిక్ స్వభావం కారణంగా వాటి పొర-స్థానికీకరించిన ప్రతిరూపాల కంటే చాలా కష్టతరమైన లక్ష్యాలుగా పరిగణించబడతాయి.బ్రోమోడొమైన్ మరియు ఎక్స్‌ట్రాటెర్మినల్ (BET) ప్రోటీన్ BRD4 వివిధ వ్యాధులలో దాని కీలక పాత్ర కోసం మన దృష్టిని ఆకర్షించింది 35, 36 .BRD4 ద్వారా ఏర్పడిన కాంప్లెక్స్ ఒక ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ కోక్టివేటర్ మరియు ఒక ముఖ్యమైన చికిత్సా లక్ష్యం.c-myc మరియు Wnt5a ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాల యొక్క వ్యక్తీకరణను నియంత్రించడం ద్వారా, BRD4 అనేది అక్యూట్ మైలోయిడ్ లుకేమియా (AML), మల్టిపుల్ మైలోమా, బుర్కిట్ యొక్క లింఫోమా, పెద్దప్రేగు కాన్సర్ మరియు ఇన్ఫ్లమేటరీ వ్యాధులకు కీలక నిర్ణయాధికారిగా భావించబడుతుంది.అదనంగా, కొన్ని వైరస్‌లు పాపిల్లోమావైరస్, HIV మరియు SARS-CoV-236,39 వంటి వైరల్ మరియు సెల్యులార్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను నియంత్రించడానికి BRD4ని లక్ష్యంగా చేసుకుంటాయి.
PDPLని ఉపయోగించి BRD4 పరస్పర చర్యను మ్యాప్ చేయడానికి, మేము miniSOGని BRD4 యొక్క చిన్న N- లేదా C-టెర్మినల్ ఐసోఫార్మ్‌తో కలిపాము.ప్రోటీమిక్ ఫలితాలు రెండు నిర్మాణాల మధ్య అధిక స్థాయి అతివ్యాప్తిని వెల్లడించాయి (అనుబంధ Fig. 9a).miniSOG-H2Bతో గుర్తించబడిన న్యూక్లియర్ ప్రోటీమ్ BRD4తో సంకర్షణ చెందే 77.6% ప్రోటీన్‌లను కవర్ చేస్తుంది (అనుబంధ Fig. 9b).అప్పుడు, మార్కర్ వ్యాసార్థాన్ని సర్దుబాటు చేయడానికి (Fig. 4a మరియు అనుబంధ డేటా 3) వెలుతురు యొక్క వివిధ సమయాలు (2, 5, 10, 20 నిమిషాలు) ఉపయోగించబడ్డాయి.తక్కువ ఫోటోపెరియోడ్‌లలో, PDPL ప్రధానంగా ప్రత్యక్ష బైండింగ్ భాగస్వాములను లేబుల్ చేస్తుందని మేము నిర్ధారించాము, అయితే ఎక్కువ కాలం తక్కువ ఫోటోయాక్టివేషన్ వ్యవధిలో గుర్తించబడిన ప్రోటీన్‌లను అలాగే లేబులింగ్ కాంప్లెక్స్‌లలో పరోక్ష లక్ష్యాలను కలిగి ఉంటుంది.వాస్తవానికి, మేము ప్రక్కనే ఉన్న సమయ బిందువుల మధ్య బలమైన అతివ్యాప్తిని కనుగొన్నాము (2 మరియు 5 నిమిషాలకు 84.6%; 5 మరియు 10 నిమిషాలకు 87.7%; 10 మరియు 20 నిమిషాలకు 98.7%) (Fig. 4b మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 9c ).అన్ని ప్రయోగాత్మక సమూహాలలో, మేము BRD4 స్వీయ-లేబులింగ్‌ను మాత్రమే కాకుండా, స్ట్రింగ్ డేటాబేస్‌లో ఉల్లేఖించిన MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A మరియు HMGB1 వంటి అనేక తెలిసిన లక్ష్యాలను కనుగొన్నాము.ఈ లక్ష్యాల యొక్క అయానిక్ బలం ఎక్స్పోజర్ సమయానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది (Fig. 4c మరియు అనుబంధ Fig. 9d).2-నిమిషాల సమూహంలో గుర్తించబడిన ప్రోటీన్ల యొక్క GO విశ్లేషణ గుర్తించబడిన ప్రోటీన్లు కేంద్రకంలో స్థానీకరించబడిందని మరియు క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణం మరియు RNA పాలిమరేస్ ఫంక్షన్‌లో పాల్గొన్నట్లు చూపించింది.ప్రోటీన్ యొక్క పరమాణు పనితీరు క్రోమాటిన్ బైండింగ్ లేదా ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ కోయాక్టివేషన్‌తో సమృద్ధిగా ఉంటుంది, ఇది BRD4 ఫంక్షన్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది (Fig. 4d).స్ట్రింగ్ డేటాబేస్-ప్రారంభించబడిన ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్ విశ్లేషణ BRD4 మరియు HDAC బైండింగ్ ఎసిటైలేటెడ్ హిస్టోన్‌లకు అనుగుణంగా SIN3A, NCOR2, BCOR, మరియు SAP130 (Fig. 4e మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 9e) వంటి BRD4 మరియు HDAC ఫ్యామిలీ ఇంటరాక్టింగ్ కాంప్లెక్స్‌ల మధ్య పరోక్ష పరస్పర చర్యల యొక్క మొదటి స్థాయిని వెల్లడించింది. ..అదనంగా, Sin3A, NSUN2, Fus మరియు SFPQతో సహా LC-MS/MS ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రాతినిధ్య లక్ష్యాలు వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ (Fig. 4f) ద్వారా నిర్ధారించబడ్డాయి.ఇటీవల, BRD4 యొక్క సంక్షిప్త ఐసోఫార్మ్ ద్రవ-ద్రవ దశ విభజన (LLPS) లక్షణాలతో కేంద్రకాలను ఏర్పరుస్తుందని నివేదించబడింది.RNA బైండింగ్ ప్రోటీన్లు Fus మరియు SFPQ వివిధ సెల్యులార్ ప్రక్రియల LLPSకి మధ్యవర్తిత్వం చేస్తాయి మరియు ఇక్కడ నమోదు చేయని BRD4 బైండింగ్ ప్రోటీన్‌లుగా గుర్తించబడ్డాయి.BRD4 మరియు SFPQ మధ్య పరస్పర చర్య కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (కో-ఐపి) ప్రయోగాల ద్వారా నిర్ధారించబడింది (మూర్తి 4g), తదుపరి పరిశోధనకు అర్హమైన BRD4-మధ్యవర్తిత్వ ద్రవ-ద్రవ దశ విభజన కోసం మరొక యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తుంది.కలిసి చూస్తే, తెలిసిన BRD4 ఇంటరాక్టింగ్ మరియు తెలియని బైండింగ్ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించడానికి PDPL అనువైన వేదిక అని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
miniSOG-మధ్యవర్తిత్వ BRD4 సామీప్యత మార్కింగ్ యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం, ఎక్స్పోజర్ సమయాలు: 2, 5, 10 మరియు 20 నిమిషాలు.b వివిధ ప్రకాశం సమయాలలో గుర్తించబడిన ప్రోటీన్ల అతివ్యాప్తి.వైల్డ్-టైప్ HEK293Tతో పోల్చితే HEK293T-miniSOG-BRD4లో గుర్తించబడిన ప్రోటీన్ సుసంపన్నం గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనది.c పేర్కొన్న ఎక్స్‌పోజర్ సమయంలో తెలిసిన BRD4-బైండింగ్ ప్రోటీన్‌లను లేబుల్ చేయని ప్రతినిధిని లెక్కించేటప్పుడు అయాన్ తీవ్రత.n = 3 జీవశాస్త్ర స్వతంత్ర నమూనాలు.డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం వలె ప్రదర్శించబడుతుంది.d 2-నిమిషాల సమూహంలో గుర్తించబడిన ప్రొటీన్ల జీన్ ఆన్టోలాజికల్ అనాలిసిస్ (GO).మొదటి పది GO నిబంధనలు జాబితా చేయబడ్డాయి.GO పదం వర్గం ప్రకారం బుడగలు రంగులో ఉంటాయి మరియు బబుల్ పరిమాణం ప్రతి పదంలోని ప్రోటీన్ల సంఖ్యకు అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది.ఇ BRD4తో పరస్పర చర్య చేసే ప్రోటీన్ల స్ట్రింగ్ విశ్లేషణ.పసుపు వృత్తాలు ప్రత్యక్ష జిగురు మరియు బూడిద వృత్తాలు పరోక్ష జిగురు యొక్క మొదటి పొర.ఎరుపు గీతలు ప్రయోగాత్మకంగా నిర్ణయించబడిన పరస్పర చర్యలను సూచిస్తాయి మరియు నీలం గీతలు ఊహించిన పరస్పర చర్యలను సూచిస్తాయి.f LC-MS/MSలో గుర్తించబడిన ప్రతినిధి BRD4 బైండింగ్ లక్ష్యాలు వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా ధృవీకరించబడ్డాయి.g కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ప్రయోగాలు SFPQ మరియు BRD4 మధ్య పరస్పర చర్యను నిర్ధారిస్తాయి.ఈ ప్రయోగాలు సారూప్య ఫలితాలతో కనీసం రెండుసార్లు స్వతంత్రంగా పునరావృతమయ్యాయి.ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.
నమోదు చేయని POI-అనుబంధ లక్ష్యాలను గుర్తించడంతో పాటు, ఎంజైమ్‌ల కోసం సబ్‌స్ట్రేట్‌లను గుర్తించడానికి PDPL అనుకూలంగా ఉంటుందని మేము ఊహిస్తున్నాము, దీనికి నమోదు చేయని సబ్‌స్ట్రేట్‌లను ఉల్లేఖించడానికి పెద్ద కాంప్లెక్స్‌లలో పరోక్ష బైండింగ్ ప్రోటీన్‌ల వర్గీకరణ అవసరం.పార్కిన్ (PARK2 చే ఎన్కోడ్ చేయబడింది) అనేది ఒక E3 లిగేస్ మరియు పార్కిన్‌లోని ఉత్పరివర్తనలు ఆటోసోమల్ రిసెసివ్ జువెనైల్ పార్కిన్సన్స్ డిసీజ్ (AR-JP)42కు కారణమవుతాయి.అదనంగా, పార్కిన్ మైటోఫాగి (మైటోకాన్డ్రియల్ ఆటోఫాగి) మరియు రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతుల తొలగింపుకు అవసరమైనదిగా వర్ణించబడింది.అయినప్పటికీ, అనేక పార్కిన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లు గుర్తించబడినప్పటికీ, ఈ వ్యాధిలో పార్కిన్ పాత్ర అస్పష్టంగానే ఉంది.దాని నిర్దేశించని సబ్‌స్ట్రేట్‌లను ఉల్లేఖించడానికి, PDPL పార్కిన్ యొక్క N- లేదా C-టెర్మినస్‌కు miniSOGని జోడించడం ద్వారా పరీక్షించబడింది.PINK1-పార్కిన్ పాత్‌వే ద్వారా పార్కిన్‌ను సక్రియం చేయడానికి కణాలు కార్బొనిల్ సైనైడ్ ప్రోటాన్ ట్రాన్స్‌పోర్టర్ m-క్లోరోఫెనైల్హైడ్రాజోన్ (CCCP)తో చికిత్స చేయబడ్డాయి.మా BRD4 PDPL ఫలితాలతో పోలిస్తే, పార్కిన్ N- టెర్మినస్ ఫ్యూజన్ పెద్ద లక్ష్య ప్రోటీన్‌లను వెల్లడించింది, అయినప్పటికీ ఇది C- టెర్మినస్ (210 లో 177) (మూర్తి 5a,b మరియు అనుబంధ డేటా 4) యొక్క పెద్ద భాగాన్ని కవర్ చేసింది.N-టెర్మినల్ ట్యాగ్‌లు పార్కిన్ 44ను అసహజంగా సక్రియం చేయగలవని నివేదికలకు అనుగుణంగా ఫలితం ఉంటుంది.ఆశ్చర్యకరంగా, పార్కిన్ 43 కోసం ప్రచురించబడిన AP-MS ఫలితాలతో మా డేటాలో 18 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ప్రోటీన్‌లు మాత్రమే ఉన్నాయి, సెల్ లైన్‌లు మరియు ప్రోటీమిక్స్ వర్క్‌ఫ్లోల మధ్య తేడాలు ఉండవచ్చు.నాలుగు తెలిసిన ప్రోటీన్‌లతో పాటు (ARDM1, HSPA8, PSMD14, మరియు PSMC3) రెండు పద్ధతుల ద్వారా గుర్తించబడింది (Fig. 5c)43.LC-MS/MS ఫలితాలను మరింత ధృవీకరించడానికి, HEK293T పేరెంట్ సెల్ అస్సే మరియు స్థిరమైన N-టెర్మినల్ పార్కిన్ లైన్ ఫలితాలను పోల్చడానికి PDPL చికిత్స మరియు తదుపరి వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ఉపయోగించబడ్డాయి.గతంలో తెలియని లక్ష్యాలు CDK2, DUT, CTBP1 మరియు PSMC4 తెలిసిన బైండర్ DNAJB1 (Fig. 5d)తో పరీక్షించబడ్డాయి.
పార్కిన్ యొక్క N- లేదా C-టెర్మినస్ (n = 3 స్వతంత్ర జీవ ప్రయోగాలు)తో స్థిరంగా వ్యక్తీకరించబడిన miniSOGతో HEK293T కణాలలో పార్కిన్-ఇంటరాక్టింగ్ ప్రోటీన్ల అగ్నిపర్వత ప్లాట్లు.అగ్నిపర్వత ప్లాట్లపై టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ ఉపయోగించబడింది.HEK293T ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది. గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత వ్యత్యాసం). గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు >2-రెట్లు అయాన్ తీవ్రత వ్యత్యాసం). Значительно измененные белки выделены krasnыm цветом (p <0,05 и >2-క్రాట్నాయ రజనీసా వినియోన్స్). గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు > అయాన్ తీవ్రతలో 2 రెట్లు వ్యత్యాసం).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены krasным цветом (p <0,05 и > 2-క్రాట్నాయ రజనీష మరియు ионной силе). గణనీయంగా మార్చబడిన ప్రోటీన్లు ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేయబడతాయి (p <0.05 మరియు > అయానిక్ బలంలో 2 రెట్లు వ్యత్యాసం).HEK293T-miniSOGకి ముఖ్యమైన సంబంధిత ప్రోటీన్‌లు ఆకుపచ్చ రంగులో చూపబడ్డాయి.b N-టెర్మినల్ మరియు C-టెర్మినల్ నిర్మాణాల మధ్య అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ప్రోటీన్‌లను చూపుతున్న వెన్ రేఖాచిత్రం.N-టెర్మినల్ ట్యాగ్‌లు అసహజంగా పార్కిన్‌ని సక్రియం చేయగలవు మరియు మరింత గుర్తించదగిన ప్రోటీన్‌లను కలిగిస్తాయి.c వెన్ రేఖాచిత్రం PDPL మరియు AP-MS మధ్య అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ప్రోటీన్‌లను చూపుతుంది.PDPLలో ప్రత్యేకంగా గుర్తించబడిన 18 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ప్రోటీన్‌లలో 4 మరియు 159 ప్రోటీన్‌లలో 11 సహా తెలిసిన ఇంటరాక్టర్‌లు జాబితా చేయబడ్డాయి.d LC-MS/MS ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రతినిధి లక్ష్యాలు వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా ధృవీకరించబడ్డాయి.e Ssu72 మరియు SNW1 నమోదుకాని పార్కిన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లుగా గుర్తించబడ్డాయి.ఈ FLAG-ట్యాగ్ చేయబడిన ప్రోటీన్ ప్లాస్మిడ్‌లు HEK293T మరియు HEK293T-Parkin-miniSOGలోకి బదిలీ చేయబడ్డాయి, తరువాత వివిధ సమయ బిందువులలో CCCP చికిత్స జరిగింది.పార్కిన్ ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ లైన్‌లో అధోకరణం ఎక్కువగా కనిపిస్తుంది.f ప్రోటీసోమ్ ఇన్హిబిటర్ MG132ని ఉపయోగించి, Ssu72 మరియు SNW1 యొక్క అధోకరణ ప్రక్రియ ప్రోటీసోమ్-సర్వవ్యాప్తి ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించబడిందని నిర్ధారించబడింది.ఈ ప్రయోగాలు సారూప్య ఫలితాలతో కనీసం రెండుసార్లు స్వతంత్రంగా పునరావృతమయ్యాయి.ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.
ముఖ్యంగా, PDPL ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రోటీన్‌లలో తప్పనిసరిగా పార్కిన్-బైండింగ్ ప్రోటీన్‌లు మరియు వాటి సబ్‌స్ట్రేట్‌లు ఉండాలి.నమోదు చేయని పార్కిన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లను గుర్తించడానికి, మేము గుర్తించబడిన ఏడు ప్రోటీన్‌లను (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 మరియు SNW1) ఎంచుకున్నాము మరియు ఈ జన్యువులను సాధారణ HEK293Tకి బహిర్గతం చేయడానికి ప్లాస్మిడ్‌లను బదిలీ చేసాము మరియు HEK2CC చికిత్సను అనుసరించి స్థిరంగా miniSOG-Parkin's ట్రీట్‌మెంట్‌ను ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసాము.Ssu72 మరియు SNW1 ప్రోటీన్‌ల స్థాయిలు స్థిరమైన miniSOG-పార్కిన్ లైన్‌లో గణనీయంగా తగ్గాయి (Fig. 5e).12 గంటల పాటు CCCPతో చికిత్స చేయడం వల్ల రెండు సబ్‌స్ట్రేట్‌లు చాలా ముఖ్యమైన క్షీణతకు దారితీశాయి.Ssu72 మరియు SNW1 యొక్క క్షీణత ప్రోటీసోమ్-సర్వవ్యాప్తి ద్వారా నియంత్రించబడుతుందో లేదో పరిశోధించడానికి, ప్రోటీసోమ్ కార్యకలాపాలను నిరోధించడానికి ప్రోటీసోమ్ ఇన్హిబిటర్ MG132 జోడించబడింది మరియు వాస్తవానికి వాటి క్షీణత ప్రక్రియ నిరోధించబడిందని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 5f).వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 10) ఉపయోగించి పార్కిన్ ఇంటరాక్టర్‌లుగా అదనపు నాన్-సబ్‌స్ట్రేట్ లక్ష్యాలు నిర్ధారించబడ్డాయి, ఇది LC-MS/MSతో స్థిరమైన ఫలితాలను చూపించింది.ముగింపులో, టార్గెట్ ప్రోటీన్ ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ వెరిఫికేషన్‌తో PDPL వర్క్‌ఫ్లో ఏకీకరణ నమోదు చేయని E3 లిగేస్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లను గుర్తించడానికి అనుమతిస్తుంది.
మేము ఒక సాధారణ సామీప్య మార్కింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను అభివృద్ధి చేసాము, ఇది స్పేస్ మరియు టైమ్ ఇంటరాక్టింగ్ POIలను గుర్తించడానికి మిమ్మల్ని అనుమతిస్తుంది.ప్లాట్‌ఫారమ్ miniSOG ఫోటోసెన్సిటైజర్ ప్రోటీన్‌పై ఆధారపడింది, ఇది కేవలం 12 kDa మాత్రమే, పరిపక్వ APEX2 ఎంజైమ్ (27 kDa) యొక్క సగం కంటే తక్కువ పరిమాణం మరియు TurboID (35 kDa) పరిమాణంలో మూడవ వంతు.చిన్న పరిమాణం చిన్న ప్రోటీన్ ఇంటరాక్టోమ్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి అనువర్తనాల పరిధిని బాగా విస్తరించాలి.సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ యొక్క క్వాంటం దిగుబడిని పెంచడానికి మరియు ఈ విధానం యొక్క సున్నితత్వాన్ని విస్తరించడానికి జన్యుపరంగా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌లు లేదా చిన్న అణువులు అయినా అదనపు ఫోటోసెన్సిటైజర్‌ల యొక్క మరింత అన్వేషణ అవసరం.miniSOG యొక్క ప్రస్తుత వెర్షన్ కోసం, సామీప్యత గుర్తులను సక్రియం చేయడానికి బ్లూ ఇల్యూమినేషన్‌ని ఉపయోగించి అధిక తాత్కాలిక రిజల్యూషన్‌ను సాధించవచ్చు.అదనంగా, ఎక్కువ కాలం బహిర్గతమయ్యే సమయం సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ యొక్క పెద్ద "క్లౌడ్"ని విడుదల చేసింది, దీని ఫలితంగా మరింత దూరపు హిస్టిడిన్ అవశేషాలు, లేబులింగ్ వ్యాసార్థం పెరగడం మరియు PDPL ప్రాదేశిక రిజల్యూషన్‌ను చక్కగా ట్యూన్ చేయగల సామర్థ్యం ఏర్పడింది.సిగ్నల్-టు-బ్యాక్‌గ్రౌండ్ నిష్పత్తిని పెంచడానికి మేము ఏడు రసాయన ప్రోబ్‌లను కూడా పరీక్షించాము మరియు ఈ విధానం వెనుక ఉన్న పరమాణు యంత్రాంగాన్ని అన్వేషించాము.TOP-ABPP వర్క్‌ఫ్లో నిష్పాక్షికమైన ఓపెన్ సెర్చ్‌తో కలిపి హిస్టిడైన్‌లలో మాత్రమే మార్పులు జరిగాయని నిర్ధారించింది మరియు లూప్ ప్రాంతంలో హిస్టిడైన్‌లకు మితమైన ప్రాధాన్యత తప్ప, పెరిగిన హిస్టిడిన్ సవరణల కోసం స్థిరమైన సూక్ష్మ పర్యావరణం గమనించబడలేదు.
ఇతర సామీప్య లేబులింగ్ మరియు ఆర్గానెల్లె-నిర్దిష్ట రసాయన ప్రోబ్ పద్ధతులతో కనీసం పోల్చదగిన ప్రోటీమ్ నిర్దిష్టత మరియు కవరేజీతో ఉపకణ ప్రోటీమ్‌లను వర్గీకరించడానికి కూడా PDPL ఉపయోగించబడింది.ఉపరితలం, లైసోసోమల్ మరియు రహస్య-అనుబంధ ప్రోటీమ్‌లను వర్గీకరించడానికి సామీప్య గుర్తులు కూడా విజయవంతంగా ఉపయోగించబడ్డాయి46,47.PDPL ఈ ఉపకణ అవయవాలకు అనుకూలంగా ఉంటుందని మేము నమ్ముతున్నాము.అదనంగా, సైటోసోలిక్ ప్రోటీన్ బైండింగ్ కోసం లక్ష్యాలను గుర్తించడం ద్వారా మేము PDPLని సవాలు చేసాము, ఇవి మెమ్బ్రేన్ బౌండ్ ప్రోటీన్‌ల కంటే చాలా క్లిష్టంగా ఉంటాయి, వాటి డైనమిక్ లక్షణాలు మరియు మరింత తాత్కాలిక పరస్పర చర్యలలో పాల్గొనడం.PDPL రెండు ప్రొటీన్‌లకు వర్తించబడింది, ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ కోక్టివేటర్ BRD4 మరియు వ్యాధి-సంబంధిత లిగేస్ E3 పార్కిన్.ఈ రెండు ప్రొటీన్‌లు వాటి ప్రాథమిక జీవసంబంధమైన విధుల కోసం మాత్రమే కాకుండా, వాటి వైద్యపరమైన ఔచిత్యం మరియు చికిత్సా సామర్థ్యం కోసం కూడా ఎంపిక చేయబడ్డాయి.ఈ రెండు POIల కోసం, బాగా తెలిసిన బైండింగ్ భాగస్వాములు అలాగే నమోదు చేయని లక్ష్యాలు గుర్తించబడ్డాయి.ముఖ్యంగా, దశల విభజన-అనుబంధ ప్రోటీన్ SFPQ సహ-IP ద్వారా నిర్ధారించబడింది, ఇది BRD4 (షార్ట్ ఐసోఫార్మ్) LLPSని నియంత్రించే కొత్త యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తుంది.అదే సమయంలో, పార్కిన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌ల గుర్తింపు అనేది పరోక్ష సంసంజనాలను గుర్తించాల్సిన అవసరం ఉన్న దృష్టాంతం అని మేము నమ్ముతున్నాము.మేము రెండు గుర్తించబడని పార్కిన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లను గుర్తించాము మరియు సర్వవ్యాప్తి-ప్రోటీసోమ్ మార్గంలో వాటి క్షీణతను నిర్ధారించాము.ఇటీవల, హైడ్రోలేస్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లను ఎంజైమ్‌లతో ట్రాప్ చేయడం ద్వారా గుర్తించడానికి మెకానిజం-ఆధారిత ట్రాపింగ్ వ్యూహం అభివృద్ధి చేయబడింది.ఇది చాలా శక్తివంతమైన పద్ధతి అయినప్పటికీ, పెద్ద కాంప్లెక్స్‌ల ఏర్పాటులో పాల్గొన్న సబ్‌స్ట్రేట్‌ల విశ్లేషణకు ఇది తగినది కాదు మరియు ఎంజైమ్ మరియు సబ్‌స్ట్రేట్ మధ్య సమయోజనీయ బంధాలను ఏర్పరచడం అవసరం.డ్యూబిక్విటినేస్ మరియు మెటాలోప్రొటీజ్ కుటుంబాలు వంటి ఇతర ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు ఎంజైమ్ కుటుంబాలను అధ్యయనం చేయడానికి PDPL విస్తరించబడుతుందని మేము ఆశిస్తున్నాము.
SOPP3 అని పిలువబడే miniSOG యొక్క కొత్త రూపం, మెరుగైన సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఉత్పత్తితో అభివృద్ధి చేయబడింది.మేము miniSOGని SOPP3తో పోల్చాము మరియు మెరుగైన మార్కింగ్ పనితీరును కనుగొన్నాము, అయినప్పటికీ సిగ్నల్-టు-నాయిస్ నిష్పత్తి మారలేదు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 11).SOPP3 యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ (ఉదా, దర్శకత్వం వహించిన పరిణామం ద్వారా) తక్కువ కాంతి సమయాలు అవసరమయ్యే మరింత సమర్థవంతమైన ఫోటోసెన్సిటైజర్ ప్రోటీన్‌లకు దారితీస్తుందని మరియు తద్వారా మరింత డైనమిక్ సెల్యులార్ ప్రక్రియలను సంగ్రహించడానికి అనుమతిస్తుందని మేము ఊహించాము.ముఖ్యంగా, PDPL యొక్క ప్రస్తుత వెర్షన్ సెల్యులార్ వాతావరణానికి పరిమితం చేయబడింది, ఎందుకంటే దీనికి నీలి కాంతి ప్రకాశం అవసరం మరియు లోతైన కణజాలంలోకి చొచ్చుకుపోదు.ఈ లక్షణం జంతు నమూనా అధ్యయనాలలో దాని ఉపయోగాన్ని నిరోధిస్తుంది.అయినప్పటికీ, పిడిపిఎల్‌తో ఆప్టోజెనెటిక్స్ కలయిక జంతువుల పరిశోధనకు, ముఖ్యంగా మెదడులో అవకాశాన్ని అందిస్తుంది.అదనంగా, ఇతర ఇంజనీరింగ్ ఇన్‌ఫ్రారెడ్ ఫోటోసెన్సిటైజర్‌లు కూడా ఈ పరిమితిని తొలగిస్తాయి.ప్రస్తుతం ఈ ప్రాంతంలో పరిశోధనలు జరుగుతున్నాయి.
HEK293T సెల్ లైన్ ATCC (CRL-3216) నుండి పొందబడింది.సెల్ లైన్ మైకోప్లాస్మా ఇన్‌ఫెక్షన్‌కు ప్రతికూలంగా పరీక్షించబడింది మరియు DMEM (థర్మో, #C11995500BT)లో కల్చర్ చేయబడింది, ఇది 10% పిండం బోవిన్ సీరం (FBS, విస్టెక్, #SE100-B) మరియు 1% పెన్సిలిన్/స్ట్రెప్టోమైసిన్ (హైక్లోన్, #SV300)తో అనుబంధంగా ఉంది.లో పెరిగింది.
3-అమినోఫెనిలిన్ (నమూనా 3) మరియు (4-ఇథైనైల్ఫెనిల్) మెథనామైన్ (నమూనా 4) బైడ్‌ఫార్మ్ నుండి కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.ప్రొపైలమైన్ (ప్రోబ్ 2) ఎనర్జీ-కెమికల్స్ నుండి కొనుగోలు చేయబడింది.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (ప్రోబ్ 1) ప్రచురించిన పద్ధతుల ప్రకారం సంశ్లేషణ చేయబడింది.
సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1 ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన జన్యు నిర్మాణాలను జాబితా చేస్తుంది.miniSOG మరియు KillerRed సీక్వెన్సులు P. Zou (పెకింగ్ విశ్వవిద్యాలయం) నుండి బహుమతి ప్లాస్మిడ్ నుండి క్లోన్ చేయబడ్డాయి.మైటోకాన్డ్రియాల్ మ్యాట్రిక్స్ టార్గెటింగ్ సీక్వెన్స్ COX4 యొక్క 23 N-టెర్మినల్ అమైనో ఆమ్లాల నుండి ఉద్భవించింది మరియు గిబ్సన్ అసెంబ్లీని ఉపయోగించి సూచించబడిన వెక్టర్‌లలోకి క్లోన్ చేయబడింది (బయోటైమ్, #D7010S).ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులం యొక్క పొర మరియు కేంద్రకాన్ని లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి, SEC61B హ్యూమన్ DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T కణాల యొక్క cDNA లైబ్రరీ నుండి PCR ద్వారా విస్తరించబడింది మరియు H2B DNA (D. లిన్, షెన్ ద్వారా విరాళంగా అందించబడింది) DNA మరియు పైన పేర్కొన్న విధంగా క్లోన్ చేయబడింది.సూచించకపోతే, స్థిరమైన సెల్ లైన్ల బదిలీ మరియు నిర్మాణం కోసం ఉపయోగించే ఇతర ప్రోటీన్ జన్యువులు HEK293T సెల్ cDNA లైబ్రరీ నుండి PCR విస్తరించబడ్డాయి.G3S (GGGS) మరియు G4S (GGGGS) ఎర ప్రోటీన్ మరియు miniSOG మధ్య లింకర్‌లుగా ఉపయోగించబడ్డాయి.ఈ ఫ్యూజన్ నిర్మాణాలకు V5 ఎపిటోప్ ట్యాగ్ (GKPIPNPLLGLDST) జోడించబడింది.క్షీరదాలలో వ్యక్తీకరణ కోసం మరియు స్థిరమైన సెల్ లైన్‌ను స్థాపించడానికి, miniSOG ఫ్యూజన్ నిర్మాణం pLX304 లెంటివైరల్ వెక్టర్‌లోకి సబ్‌క్లోన్ చేయబడింది.బ్యాక్టీరియా వ్యక్తీకరణ కోసం, సి-టెర్మినస్ వద్ద 6xHis అని లేబుల్ చేయబడిన pET21a వెక్టర్‌లోకి miniSOG క్లోన్ చేయబడింది.
HEK293T కణాలు ఆరు బావుల ప్లేట్లలో ఒక్కో బావికి 2.0 x 105 సెల్‌ల చొప్పున సీడ్ చేయబడ్డాయి మరియు 24 గంటల తర్వాత రీకాంబినెంట్ లెంటివైరల్ ప్లాస్మిడ్‌లు (2.4 μg pLX304) మరియు వైరల్ ప్యాకేజింగ్ ప్లాస్మిడ్‌లతో (1.5 μg psPAX2 మరియు 1.2po.G0og టైం ఉపయోగించి (LiBeG.000) , #C0533), దాదాపు 80% కలయిక.రాత్రిపూట బదిలీ అయిన తర్వాత, మాధ్యమం మార్చబడింది మరియు మరో 24 గంటలు పొదిగేది.వైరస్ సేకరణ 24, 48 మరియు 72 గంటల తర్వాత జరిగింది.లక్ష్య కణ తంతువుల సంక్రమణకు ముందు, వైరల్ మాధ్యమం 0.8 μm ఫిల్టర్ (మెర్క్, #మిల్లెక్స్-జిపి) ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడింది మరియు పాలీబ్రేన్ (సోలార్బియో, #H8761) 8 μg/ml సాంద్రతకు జోడించబడింది.24 గంటల తర్వాత, మాధ్యమాన్ని మార్చడం ద్వారా కణాలు కోలుకోవడానికి అనుమతించబడ్డాయి.తక్కువ కఠినమైన ఎంపికగా మొదటి మూడు భాగాల కోసం 5 μg/ml బ్లాస్టిసిడిన్ (Solarbio, #3513-03-9) ఉపయోగించి కణాలు ఎంపిక చేయబడ్డాయి.తదుపరి మూడు భాగాల కోసం 20 μg/mlని మరింత కఠినమైన నియమావళిగా ఉపయోగించారు.
ప్రతి బావికి సుమారు 20,000 కణాల సాంద్రతతో 12-బావి గదులలో (Ibidi, #81201) కణాలు సీడ్ చేయబడ్డాయి.HEK293T కణాల సంశ్లేషణను మెరుగుపరచడానికి, 50 µg/ml ఫైబ్రోనెక్టిన్ (కార్నింగ్, #356008)ని 37°C వద్ద ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ (PBS, Sangon, #B640435)లో కరిగించండి.గదులు 1 గంటకు ముందే చికిత్స చేయబడ్డాయి మరియు తరువాత PBS తో తొలగించబడ్డాయి.24 గంటల తర్వాత, కణాలు PBSతో ఒకసారి కడిగి, 1 mM ప్రోబ్ 3తో తాజా హాంక్స్ బ్యాలెన్స్‌డ్ సాల్ట్ ద్రావణంలో (HBSS, గిబ్కో, #14025092) 37°C వద్ద 1 గం వరకు పొదిగేవి, ఆపై నీలిరంగు LED (460 nm)తో పొదిగేవి. )) గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు వికిరణం చేయబడ్డాయి.ఆ తర్వాత, కణాలు PBSతో రెండుసార్లు కడుగుతారు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 15 నిమిషాల పాటు PBS (Sangon, #E672002)లో 4% ఫార్మాల్డిహైడ్‌తో పరిష్కరించబడ్డాయి.PBSతో మూడుసార్లు కడగడం ద్వారా స్థిర కణాల నుండి అదనపు ఫార్మాల్డిహైడ్ తొలగించబడింది.PBSలో 0.5% ట్రిటాన్ X-100 (సాంగోన్, #A600198)తో కణాలు పారగమ్యపరచబడ్డాయి మరియు PBSతో 3 సార్లు కడుగుతారు.తర్వాత ఛాంబర్‌ని తీసివేసి, 50 µM Cy3-azide (అల్లాదీన్, #C196720), 2 mM CuSO4 (సాంగోన్, #A603008), 1 mM BTTAA (కాన్‌ఫ్లూర్, #BDJ-4) కలిగిన క్లిక్ రియాక్షన్ మిశ్రమం యొక్క ప్రతి నమూనా 25 µlకి జోడించండి. మరియు 0.5 mg/ml సోడియం ఆస్కార్బేట్ (అల్లాదీన్, నం. S105024) మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగేది.స్నాప్ రియాక్షన్ తర్వాత, సెల్‌లు 0.05% ట్వీన్-20 (సాంగోన్, #A600560) (PBST) కలిగిన PBSతో ఆరుసార్లు కడిగి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు PBSTలో 5% BSA (Abcone, #B24726)తో బ్లాక్ చేయబడ్డాయి.
కోలోకలైజేషన్ ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ కోసం, సూచించిన పరిస్థితుల ప్రకారం కణాలు ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలతో పొదిగేవి: మౌస్ యాంటీ-వి5 ట్యాగ్ mAb (1:500, CST, #80076), రాబిట్ యాంటీ-హెచ్‌ఎస్‌పి60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), రాబిట్ పాలిక్లోనల్ యాంటీ-కాల్నెక్సిన్ యాంటీబాడీ (1:500, అబ్కామ్, #ab22595) లేదా రాబిట్ యాంటీ-లామిన్ A/C మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (1:500; CST, #2032) రాత్రిపూట 4 °C వద్ద.PBSTతో 3 సార్లు కడిగిన తర్వాత, కణాలు సెకండరీ యాంటీబాడీస్‌తో పొదిగేవి: మేక యాంటీ రాబిట్ అలెక్సా ఫ్లోర్ 488 (థర్మో, #A11034) 1:1000 కరిగించబడుతుంది, మేక యాంటీ మౌస్ అలెక్సా ఫ్లోర్ 594 (CST, #8889) 0000 1 పలుచన చేయబడింది.పలుచన గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పలుచన.అప్పుడు కణాలు PBSTతో 3 సార్లు కడుగుతారు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాల పాటు PBSలో DAPI (థర్మో, #D1306)తో ప్రతిఘటించబడ్డాయి.PBSతో 3 వాష్‌ల తర్వాత, ఇమేజింగ్ కోసం PBSలో కణాలు 50% గ్లిసరాల్ (సాంగోన్, #A600232)లో సీలు చేయబడ్డాయి.ZEISS LSM 900 Airyscan2 కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ మరియు ZNE 3.5 సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించి ఇమ్యునోఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు పొందబడ్డాయి.
సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ ఫ్లోరోసెంట్ ఇమేజింగ్ కోసం, Hanks HEPES బఫర్ (DOJINDO, #MT05)లో 100 nM Si-DMAని జోడించే ముందు కణాలు రెండుసార్లు Hanks HEPES బఫర్‌తో కడుగుతారు.కాంతికి గురైన తర్వాత, కణాలు CO2 ఇంక్యుబేటర్‌లో 37 ° C వద్ద 45 నిమిషాల పాటు పొదిగేవి.కణాలు హాంక్స్ యొక్క HEPES బఫర్‌తో రెండుసార్లు కడుగుతారు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు హాంక్స్ యొక్క HEPES బఫర్‌లో హోచ్‌స్ట్‌తో ప్రతిఘటించబడ్డాయి మరియు ZEISS LSM 900 కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్‌ని ఉపయోగించి దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి., #M36008) కాల్షియం మరియు మెగ్నీషియం కలిగిన HBSS బఫర్‌లో.కాంతి లేదా డోక్సోరోబిసిన్ (MCE, #HY-15142A)కి గురైన తర్వాత, కణాలు CO2 ఇంక్యుబేటర్‌లో 37 ° C. వద్ద 10 నిమిషాల పాటు పొదిగేవి, HBSS బఫర్‌తో రెండుసార్లు కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద HBSS బఫర్‌లో హోచ్‌స్ట్‌తో పొదిగేవి.నిమిషాలు.30 నిమిషాలకు 1% BSA కలిగి ఉన్న HBSSలో 20 μM డోక్సోరోబిసిన్‌తో కణాలకు చికిత్స చేయబడిన డోక్సోరోబిసిన్ సానుకూల ప్రోబ్ నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది.Zeiss LSM 900 కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ ఉపయోగించి ఇమ్యునోఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు పొందబడ్డాయి.
HEK293T కణాలు mito-miniSOGని స్థిరంగా వ్యక్తీకరిస్తాయి, 15 సెం.మీ వంటలలో సుమారు 30% సాంద్రతతో సీడ్ చేయబడ్డాయి.48 గంటల తర్వాత, ~80% సంగమం చేరుకున్నప్పుడు, కణాలు PBSతో ఒకసారి కడిగి, తాజా HBSS బఫర్‌లో 1 mM ప్రోబ్ 3తో 37°C వద్ద 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయబడి, ఆపై గదిలో 10 నిమిషాల పాటు నీలిరంగు LEDతో ప్రకాశిస్తుంది. ఉష్ణోగ్రత..ఆ తర్వాత, కణాలు PBSతో రెండుసార్లు కడుగుతారు, EDTA-రహిత ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్‌లను (MCE, #HY-K0011) కలిగి ఉన్న మంచు-చల్లని PBS బఫర్‌లో స్క్రాప్ చేసి మళ్లీ అమర్చారు.1 నిమిషం (35% వ్యాప్తి వద్ద 1 సెకను ఆన్ మరియు 1 సెకను ఆఫ్) కోసం చిట్కాను సోనికేట్ చేయడం ద్వారా కణాలు లైస్ చేయబడ్డాయి.ఫలితంగా మిశ్రమం శిధిలాలను తొలగించడానికి 4 ° C వద్ద 10 నిమిషాలకు 15,871 xg వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది మరియు BCA ప్రోటీన్ అస్సే కిట్‌ను ఉపయోగించి సూపర్‌నాటెంట్ ఏకాగ్రత 4 mg/mLకి సర్దుబాటు చేయబడింది (Beyotime, #P0009).0.1 mM ఫోటోడిగ్రేడబుల్ బయోటిన్ అజైడ్ (కాన్ఫ్లూర్, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA లిగాండ్ (అల్లాదీన్, #T162437) మరియు దిగువ 1 mcubatorతో 1 ml లైసేట్ కలపండి. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట వరకు భ్రమణం.ఒక స్నాప్ రియాక్షన్ తర్వాత, మిశ్రమాన్ని 10 ml గాజు సీసాలో ముందుగా కలిపిన ద్రావణంలో (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) జోడించండి.నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు 4500 గ్రా వద్ద కలపాలి మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.దిగువ మరియు ఎగువ పరిష్కారాలు విస్మరించబడ్డాయి, అవక్షేపం 1 ml మిథనాల్‌తో రెండుసార్లు కడుగుతారు మరియు 4 ° C వద్ద 5 నిమిషాలు 15871 × g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది.అవక్షేపాన్ని కరిగించడానికి 25 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ (ABC, అలాద్దీన్, నం. A110539)లో 1 ml 8 M యూరియా (అల్లాదీన్, నం. U111902) జోడించండి.శాంపిల్స్‌ను 55 °C వద్ద 40 నిమిషాల పాటు 10 mM డితియోథ్రెయిటోల్ (సాంగోన్, #A100281 25 mM ABC)తో పునర్నిర్మించారు, ఆ తర్వాత చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 15 mM తాజా iodoacetamide (Sangon, #A600539) జోడించబడింది.30 నిమిషాల్లో ఆల్కైలేషన్..ప్రతిచర్యను ఆపడానికి అదనంగా 5 mM డితియోథ్రెయిటాల్ జోడించబడింది.1 ml PBSతో 3 సార్లు కడగడం ద్వారా ప్రతి నమూనా కోసం సుమారు 100 µl న్యూట్రావిడిన్ అగరోజ్ పూసలను (థర్మో, #29202) సిద్ధం చేయండి.పైన పేర్కొన్న ప్రోటీమ్ ద్రావణాన్ని 5 ml PBSతో కరిగించి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 4 గంటల పాటు ముందుగా కడిగిన న్యూట్రాఅవిడిన్ అగరోజ్ పూసలతో పొదిగించారు.పూసలను 0.2% SDS (Sangon, #A600485) కలిగిన 5 ml PBSతో 3 సార్లు, 1M యూరియా కలిగిన 5 ml PBSతో 3 సార్లు మరియు 5 ml ddH2Oతో 3 సార్లు కడుగుతారు.పూసలు అప్పుడు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా పండించబడ్డాయి మరియు 1 M యూరియా, 1 mM CaCl 2 (మాక్లిన్, #C805228) మరియు 20 ng/μl ట్రిప్సిన్ (ప్రోమెగా, #V5280) కలిగి ఉన్న 25 mM ABC యొక్క 200 μlలో తిరిగి అమర్చబడ్డాయి.భ్రమణంతో 37°C వద్ద రాత్రిపూట ట్రిప్సినైజ్ చేయండి.pH 2-3కి చేరుకునే వరకు ఫార్మిక్ యాసిడ్ (థర్మో, # A117-50) జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్య నిలిపివేయబడింది.పూసలు 0.2% SDS కలిగిన 1 ml PBSతో 3 సార్లు, 1 M యూరియా కలిగిన 1 ml PBSతో 3 సార్లు, ఆపై 1 ml స్వేదనజలంతో 3 సార్లు కడుగుతారు.సవరించిన పెప్టైడ్‌లు 70% MeOH యొక్క 200 μlని ఉపయోగించి 90 నిమిషాల పాటు లైట్ లైసిస్ (365 nm) ద్వారా విడుదల చేయబడ్డాయి.సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తరువాత, సూపర్నాటెంట్ సేకరించబడింది.పూసలు 100 μl 70% MeOH తో ఒకసారి కడుగుతారు మరియు సూపర్‌నాటెంట్లు పూల్ చేయబడ్డాయి.నమూనాలను స్పీడ్‌వాక్ వాక్యూమ్ కాన్సంట్రేటర్‌లో ఎండబెట్టి, విశ్లేషణ వరకు -20 ° C వద్ద నిల్వ చేస్తారు.
సింగిల్ట్ ఆక్సిజన్ సవరించిన పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి మరియు లెక్కించడానికి, నమూనాలను 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌లో తిరిగి కరిగించారు మరియు 1 μg పెప్టైడ్‌లను ఆర్బిట్రాప్ ఫ్యూజన్ లూమోస్ ట్రిబ్రిడ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌ను ఉపయోగించి విశ్లేషించారు, ట్యూన్ నుండి నానో ESI మూలం మరియు విక్రేత సాఫ్ట్‌వేర్ 4 నుండి Xcalibur.3 µm C18 మెటీరియల్ (ReproSil-pur, #r13.b9.)తో 75 µm × 15 సెం.మీ అంతర్గతంగా ప్యాక్ చేయబడిన కేశనాళిక కాలమ్‌పై నమూనాలు వేరు చేయబడ్డాయి మరియు EASY-nLC 1200 UHPLC సిస్టమ్ (థర్మో)కి కనెక్ట్ చేయబడ్డాయి.పెప్టైడ్‌లు లీనియర్ 95 నిమిషాల గ్రేడియంట్ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా 8% ద్రావకం B నుండి 50% ద్రావకం B (A = 0.1% నీటిలో ఫార్మిక్ యాసిడ్, 80% అసిటోనిట్రైల్‌లో B = 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్), ఆపై రేఖీయంగా 98% B నిమికి పెంచబడ్డాయి. 300 nl/min ప్రవాహం రేటుతో 6 నిమిషాలలో.Orbitrap Fusion Lumos డేటాను బట్టి పూర్తి MS స్కాన్ మరియు MS2 స్కాన్ మధ్య ప్రత్యామ్నాయంగా డేటాను సేకరిస్తుంది.స్పుట్టరింగ్ వోల్టేజ్ 2.1 kVకి సెట్ చేయబడింది మరియు అయాన్ రవాణా కేశనాళిక యొక్క ఉష్ణోగ్రత 320 ° C.MS స్పెక్ట్రా (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105 మరియు గరిష్ట ఇన్‌పుట్ సమయం 150 ms రిజల్యూషన్‌తో సేకరించబడింది.ప్రతి పూర్తి స్కాన్‌లోని 10 అత్యంత సాధారణ గుణకార చార్జ్డ్ పూర్వగాములు 30% సాధారణీకరించిన ఘర్షణ శక్తితో, 1.6 m/z క్వాడ్రూపోల్ ఐసోలేషన్ విండో మరియు 30,000 రిజల్యూషన్ సెట్టింగ్‌తో HCDని ఉపయోగించి విభజించబడ్డాయి.5×104 మరియు గరిష్ట ఇన్‌పుట్ సమయం 150 ms ఉపయోగించి టెన్డం మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ కోసం AGC లక్ష్యం.డైనమిక్ మినహాయింపు 30 సెకన్లకు సెట్ చేయబడింది. కేటాయించని అయాన్లు లేదా 1+ మరియు >7+ ఛార్జ్ ఉన్నవి MS/MS కోసం తిరస్కరించబడ్డాయి. కేటాయించని అయాన్లు లేదా 1+ మరియు >7+ ఛార్జ్ ఉన్నవి MS/MS కోసం తిరస్కరించబడ్డాయి. నేనస్నాచెన్నీ లేదా ఇయోని 1+ మరియు >7+ బైలీ ఔట్‌క్లోనెన్‌ల వరకు ఎమ్‌సి/ఎమ్‌సి. MS/MS కోసం 1+ మరియు >7+ ఛార్జ్‌తో కేటాయించని అయాన్‌లు లేదా అయాన్‌లు తిరస్కరించబడ్డాయి.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 నూకజానియో లేదా అయోని 1+ మరియు >7+ బైలీ ఓట్‌క్లోనెన్‌ల వరకు ఎమ్‌సి/ఎమ్‌సి. MS/MS కోసం పేర్కొనబడని అయాన్‌లు లేదా 1+ మరియు >7+ ఛార్జీలు కలిగిన అయాన్‌లు తిరస్కరించబడ్డాయి.
MSFragger ఆధారంగా FragPipe కంప్యూటింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌ని ఉపయోగించి ముడి డేటా ప్రాసెస్ చేయబడుతుంది.ద్రవ్యరాశి పక్షపాతాలు మరియు సంబంధిత అమైనో ఆమ్లాలు -150 నుండి 500 డా పూర్వగామి మాస్ టాలరెన్స్‌తో ఓపెన్ సెర్చ్ అల్గోరిథం ఉపయోగించి నిర్ణయించబడ్డాయి.PD (ప్రోటీమ్ డిస్కవర్ 2.5, థర్మో)లో +229.0964 మరియు +247.1069 డా యొక్క భారీ లాభాలతో హిస్టిడిన్ మార్పులను ఉపయోగించి సవరించిన పెప్టైడ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి.
ఫ్యూజ్ చేయబడిన miniSOG జన్యువును స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే కణాలు 6 సెం.మీ వంటలలో పూత పూయబడ్డాయి.~80% సంగమానికి చేరుకున్న తర్వాత, కణాలు HBSS (గిబ్కో, #14025092)తో ఒకసారి కడుగుతారు, తర్వాత HBSSలో రసాయన ప్రోబ్స్‌తో 37°C వద్ద 1 గంట పాటు పొదిగేవి మరియు నీలి కాంతితో ప్రకాశిస్తాయి.గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 20 నిమిషాల పాటు 10W LED.PDPL, 0.5 mM విటమిన్ C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (సిగ్మా, #7789-20-0)లో ఏ రకమైన రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతులు పాల్గొంటున్నాయో గుర్తించడానికి , 100 mM మన్నిటోల్ (ఎనర్జీ కెమికల్, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 సప్లిమెంట్‌లుగా కణాలకు జోడించబడ్డాయి.చల్లని PBSతో కడిగిన తర్వాత, కణాలు స్క్రాప్ చేయబడ్డాయి, 1.5 ml సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లలో సేకరించబడ్డాయి మరియు EDTA లేకుండా 1x ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్‌తో 200 μl PBSలో 1 నిమిషం పాటు చిట్కాతో సోనికేట్ చేయబడ్డాయి (1 సె మరియు 1 సె లేకుండా, వ్యాప్తి 35%).ఫలిత మిశ్రమం 4 °C వద్ద 10 నిమిషాలకు 15,871 × g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది మరియు BCA ప్రోటీన్ అస్సే కిట్‌ని ఉపయోగించి సూపర్‌నాటెంట్ ఏకాగ్రత 1 mg/mLకి సర్దుబాటు చేయబడింది.పైన పేర్కొన్న లైసేట్‌లో దాదాపు 50 µl 0.1 mM రోడమైన్ అజైడ్ (అల్లాదీన్, నం. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA లిగాండ్ మరియు 1 mM CuSO4తో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు దిగువ నుండి పైకి తిప్పబడుతుంది.క్లిక్ రియాక్షన్ తర్వాత, శాంపిల్స్‌కు 250 μl ప్రీ-చిల్డ్ అసిటోన్‌ని జోడించి, -20 ° C వద్ద 20 నిమిషాలకు పొదిగే మరియు 4 ° C వద్ద 10 నిమిషాలకు 6010×g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజింగ్ చేయడం ద్వారా అసిటోన్‌తో అవపాతం జరిగింది.గుళికను సేకరించి, 50 µl 1x Laemmli యొక్క బఫర్‌లో 95 °C వద్ద 10 నిమిషాలు ఉడకబెట్టండి.నమూనాలను SDS-PAGE పొడవైన జెల్‌లపై విశ్లేషించారు మరియు ఇమేజ్ ల్యాబ్ టచ్ సాఫ్ట్‌వేర్‌తో బయో-రాడ్ కెమిడాక్ MP టచ్ ఇమేజింగ్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి దృశ్యమానం చేయబడింది.
రీకాంబినెంట్ miniSOG-6xHis ప్రోటీన్ యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్దీకరణ గతంలో వివరించిన విధంగా నిర్వహించబడింది.క్లుప్తంగా, E. coli BL21(DE3) కణాలు (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHisతో రూపాంతరం చెందాయి మరియు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ 0.5 mM IPTG (సాంగోన్, #A600168)తో ప్రేరేపించబడింది.సెల్ లిసిస్ తర్వాత, ప్రోటీన్లు Ni-NTA అగరోజ్ పూసలు (MCE, నం. 70666) ఉపయోగించి శుద్ధి చేయబడ్డాయి, PBSకి వ్యతిరేకంగా డయలైజ్ చేయబడతాయి మరియు –80 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడతాయి.
యాంటీబాడీ-ఆధారిత ఇన్ విట్రో లేబుల్ సామీప్యత పరీక్ష కోసం, PBSలో 100 μM శుద్ధి చేసిన miniSOG, 1 mM ప్రోబ్ 3 మరియు 1 μg యాంటీ-లేబుల్ మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (TransGen, #HT501-01)ని మొత్తం 50 μl ప్రతిచర్య పరిమాణంలో కలపండి..ప్రతిచర్య మిశ్రమం గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 0, 2, 5, 10 మరియు 20 నిమిషాల పాటు నీలం LED లైట్‌తో వికిరణం చేయబడింది.ఈ మిశ్రమాన్ని 0.1 mM బయోటిన్-PEG3-అజైడ్ (అల్లాదీన్, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA లిగాండ్ మరియు 1 mM CuSO4తో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంటకు పైకి మోషన్ షేకర్‌పై పొదిగించారు.ఒక స్నాప్ రియాక్షన్ తర్వాత, 4x లామ్మ్లీ యొక్క బఫర్‌ను నేరుగా మిశ్రమంలో వేసి 95°C వద్ద 10 నిమిషాలు ఉడకబెట్టండి.నమూనాలు SDS-PAGE జెల్‌లపై విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు స్ట్రెప్టావిడిన్-HRP (1:1000, సోలార్బియో, #SE068)తో వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి.
సి-టెర్మినల్ అమిడేషన్ (LHDALDAK-CONH2)తో హిస్టిడిన్-కలిగిన సింథటిక్ పెప్టైడ్ సమీపంలోని పెప్టైడ్-ఆధారిత ఇన్ విట్రో లేబులింగ్‌ను విశ్లేషించడానికి ఉపయోగించబడింది.ఈ పరీక్షలో, 100 μM శుద్ధి చేయబడిన miniSOG, 10 mM ప్రోబ్ 3 మరియు 2 μg/ml సింథటిక్ పెప్టైడ్‌లు PBSలో మొత్తం 50 μl ప్రతిచర్య పరిమాణంలో కలపబడ్డాయి.ప్రతిచర్య మిశ్రమం గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు నీలం LED కాంతితో వికిరణం చేయబడింది.LC-MS సిస్టమ్ (వాటర్స్, SYNAPT XS అయాన్స్ మొబిలిటీ టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌తో మాస్‌లింక్స్ స్పెక్ట్రమ్ అనాలిసిస్ సాఫ్ట్‌వేర్) ఉపయోగించి ఒక మైక్రోలీటర్ నమూనా విశ్లేషించబడింది.
మినీసోగ్ ఫ్యూజన్ జన్యువును స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే HEK293T కణాలు వేర్వేరు ఆర్గానెల్లె స్థానికీకరణ (మిటో, ER, న్యూక్లియస్) ఉన్న లైన్‌ల కోసం 10 సెం.మీ వంటలలో మరియు పార్కిన్-మినీఎస్‌ఓజి మరియు బిఆర్‌డి4-మినీఎస్‌ఓజి లైన్‌ల కోసం 15 సెం.మీ వంటలలో సీడ్ చేయబడ్డాయి.~90% సంగమానికి చేరుకున్న తర్వాత, కణాలు HBSSతో ఒకసారి కడిగి, ఆపై HBSSలో ప్రోబ్ 3తో 37 ° C వద్ద 1 గంట పాటు పొదిగేవి మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 W బ్లూ LEDతో ప్రకాశిస్తాయి.పార్కిన్ యొక్క నాన్-కాంటాక్ట్ లేబులింగ్ కోసం, HBSSలో ప్రోబ్ 3తో 10 µM ప్రోటాన్ కార్బొనిల్ సైనైడ్ క్యారియర్ m-క్లోరోఫెనైల్హైడ్రాజోన్ CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C వద్ద 1 గంటకు జోడించబడింది.సెల్ లిసిస్, క్లిక్ కెమిస్ట్రీ, తగ్గింపు మరియు ఆల్కైలేషన్ దశలు పైన వివరించిన విధంగానే ఉన్నాయి, 2 mg లైసేట్ జోడించబడింది మరియు ఫోటోడిగ్రేడబుల్ బయోటిన్ అజైడ్‌కు బదులుగా క్లిక్ రియాక్షన్‌లో బయోటిన్ PEG3 అజైడ్ ఉపయోగించబడింది.సుసంపన్నం చేసిన తర్వాత, పూసలు 0.2% SDS కలిగిన 5 ml PBSతో 3 సార్లు, 1 M యూరియా కలిగిన 5 ml PBSతో 3 సార్లు మరియు 5 ml PBSతో 3 సార్లు కడుగుతారు.ఆ తర్వాత, 2 µg ట్రిప్సిన్ 1 M యూరియాను కలిగి ఉన్న 300 µl 25 mM ABCకి రాత్రిపూట 37°C వద్ద ప్రోటీన్‌ను క్లియర్ చేయడానికి జోడించబడింది.2-3 pH వచ్చే వరకు ఫార్మిక్ యాసిడ్ జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్య నిలిపివేయబడింది.పూసలపై ట్రిప్సినైజేషన్ చేసిన తర్వాత, పెప్టైడ్ ద్రావణాన్ని SOLAµ HRP కాలమ్ (థర్మో, #60209-001) ఉపయోగించి డీసల్ట్ చేసి, స్పీడ్‌వాక్ వాక్యూమ్ కాన్‌సెంట్రేటర్‌లో ఎండబెట్టారు.పెప్టైడ్‌లు 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌లో మళ్లీ కరిగించబడ్డాయి మరియు పైన వివరించిన నానో-ESI సోర్స్‌తో కూడిన ఆర్బిట్రాప్ ఫ్యూజన్ లూమోస్ ట్రిబ్రిడ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌ను ఉపయోగించి 500 ng పెప్టైడ్‌లు విశ్లేషించబడ్డాయి.పెప్టైడ్‌లు వాణిజ్య RP-HPLC పూర్వకాలమ్‌లు (75 μm x 2 సెం.మీ.) (థర్మో, నం. 164946) మరియు విశ్లేషణాత్మక RP-HPLC నిలువు వరుసలు (75 μm x 25 సెం.మీ.) (థర్మో, నం. 164941)పై వేరు చేయబడ్డాయి, రెండూ 2 μmతో నిండి ఉన్నాయి.60 నిమిషాల్లో 8% నుండి 35% ACN వరకు గ్రేడియంట్, తర్వాత 300 Nl/min ప్రవాహం రేటుతో 6 నిమిషాల్లో 98% Bకి సరళంగా పెరిగింది.MS స్పెక్ట్రా (350-1500 m/z) 60,000 రిజల్యూషన్, AGC 4 × 105 మరియు గరిష్ట ఇన్‌పుట్ సమయం 50 msతో సేకరించబడింది.ఎంచుకున్న అయాన్లు 3 సె సైకిల్స్‌లో 30% సాధారణీకరించిన తాకిడి శక్తి, 1.6 m/z క్వాడ్రూపోల్ ఐసోలేషన్ విండో మరియు 15000 రిజల్యూషన్‌తో 3 సె సైకిల్స్‌లో క్రమానుగతంగా విభజించబడ్డాయి. 5 × 104 టెన్డం మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ AGC లక్ష్యం మరియు గరిష్టంగా 22 ms ఉపయోగించబడ్డాయి.డైనమిక్ మినహాయింపు 45 సెకన్లకు సెట్ చేయబడింది. కేటాయించని అయాన్లు లేదా 1+ మరియు >7+ ఛార్జ్ ఉన్నవి MS/MS కోసం తిరస్కరించబడ్డాయి. కేటాయించని అయాన్లు లేదా 1+ మరియు >7+ ఛార్జ్ ఉన్నవి MS/MS కోసం తిరస్కరించబడ్డాయి. నేనస్నాచెన్నీ లేదా ఇయోని 1+ మరియు >7+ బైలీ ఔట్‌క్లోనెన్‌ల వరకు ఎమ్‌సి/ఎమ్‌సి. MS/MS కోసం 1+ మరియు >7+ ఛార్జ్‌తో కేటాయించని అయాన్‌లు లేదా అయాన్‌లు తిరస్కరించబడ్డాయి.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 నూకజానియో లేదా అయోని 1+ మరియు >7+ బైలీ ఓట్‌క్లోనెన్‌ల వరకు ఎమ్‌సి/ఎమ్‌సి. MS/MS కోసం పేర్కొనబడని అయాన్‌లు లేదా 1+ మరియు >7+ ఛార్జీలు కలిగిన అయాన్‌లు తిరస్కరించబడ్డాయి.
న్యూట్రాఅవిడిన్ పూసల సుసంపన్నత వరకు నమూనా తయారీ దశలు పైన వివరించిన LC-MS/MS విశ్లేషణలో వలెనే ఉన్నాయి.లోడింగ్ నియంత్రణ కోసం సుమారు 50 μg లైసేట్ ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగించబడింది మరియు క్లిక్ రియాక్షన్‌ల కోసం 2 mg లైసేట్ ఉపయోగించబడింది.న్యూట్రావిడిన్‌తో సుసంపన్నం చేసి, కడిగిన తర్వాత, అగరోజ్ రెసిన్ పూసలకు 50 μl లామ్మ్లీ బఫర్‌ని జోడించి, 95° C. వద్ద 5 నిమిషాలు ఉడకబెట్టడం ద్వారా కట్టుబడి ఉన్న ప్రోటీన్‌లను తొలగించారు.నియంత్రణ లోడ్ ఇన్‌పుట్ మరియు పూసల సుసంపన్నమైన నమూనాలు SDS-PAGE ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు ప్రామాణిక వెస్ట్రన్ బ్లాట్ పద్ధతుల ద్వారా PVDF పొరలకు (మిల్లిపోర్, #ISEQ00010) బదిలీ చేయబడ్డాయి.0.1% ట్వీన్-20 (TBST) కలిగిన TBSలో 5% స్కిమ్ మిల్క్ (సాంగోన్, #A600669)తో పొరలు నిరోధించబడ్డాయి మరియు ప్రైమరీ మరియు సెకండరీ యాంటీబాడీస్‌తో వరుసగా పొదిగేవి.ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలను TBSTలో 5% స్కిమ్ మిల్క్‌లో 1:1000 కరిగించారు మరియు రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద పొదిగేవి.సెకండరీ యాంటీబాడీస్ 1:5000 నిష్పత్తిలో ఉపయోగించబడ్డాయి మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు పొదిగేవి.కెమిడోక్ MP ఇమేజింగ్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి కెమిలుమినిసెన్స్ ద్వారా పొరలు దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.చిత్రంలో ఉన్న బ్లాట్‌లు మరియు జెల్‌ల అన్ని అన్‌కట్ స్కాన్‌లు ముడి డేటాగా ప్రదర్శించబడతాయి.
ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలలో కుందేలు వ్యతిరేక SFPQ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (CST, నం. 71992), రాబిట్ యాంటీ-ఎఫ్యుఎస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (CST, నం. 67840), రాబిట్ యాంటీ-NSUN2 పాలిక్లోనల్ యాంటీబాడీ (ప్రోటీన్‌టెక్, నం. 20854-1-1-1- AP), రాబిట్ యాంటీ-mSin3A పాలిక్లోనల్ యాంటీబాడీ (Abcam, #ab3479), మౌస్ యాంటీ-ట్యాగ్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (ట్రాన్స్‌జెన్, #HT201-02), మౌస్ యాంటీ-β-ఆక్టిన్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (ట్రాన్స్‌జెన్, #HC201-01), రాబిట్ యాంటీ -CDK2 మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (ABclonal, #A0094), రాబిట్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ టు CTBP1 (ABclonal, #A11600), కుందేలు పాలిక్లోనల్ యాంటీబాడీ నుండి DUT (ABclonal, #A2901), రాబిట్ పాలిక్లోనల్ యాంటీబాడీ PSMC4 (ABclonal, #A250) DNAJB1 పాలిక్లోనల్ యాంటీబాడీ (ABclonal, # A5504).ఈ ప్రతిరోధకాలను TBSTలో 5% స్కిమ్ మిల్క్‌లో 1:1000 పలుచన వద్ద ఉపయోగించారు.ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన ద్వితీయ ప్రతిరోధకాలు 1:5000 పలుచన వద్ద యాంటీ-రాబిట్ IgG (ట్రాన్స్‌జెన్, #HS101-01), యాంటీ-మౌస్ IgG (ట్రాన్స్‌జెన్, #HS201-01) ఉన్నాయి.
BRD4 SFPQతో సంకర్షణ చెందుతుందో లేదో మరింత పరిశోధించడానికి, స్థిరమైన HEK293T మరియు BRD4-miniSOG కణాలు HEK293Tని అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసేవి 10 సెం.మీ వంటలలో పూత పూయబడ్డాయి.కణాలు చల్లని PBSతో కడుగుతారు మరియు 1 ml పియర్స్ IP లైసిస్ బఫర్ (థర్మో ఫిషర్, #87787)లో EDTA-రహిత ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్‌తో 30 నిమిషాల పాటు 4°C వద్ద లైస్ చేయబడ్డాయి.ఆ తరువాత, లైసేట్‌లను 1.5 ml సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లలో సేకరించి, 10 నిమిషాలకు 4 ° C వద్ద 15,871 xg వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.సూపర్‌నాటెంట్ 5 µg యాంటీ-వి5 లేబుల్ చేయబడిన మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (CST, #80076)తో రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద కోయబడింది మరియు పొదిగేది.సుమారు 50 µl ప్రోటీన్ A/G మాగ్నెటిక్ పూసలను (MCE, #HY-K0202) PBSతో 0.5% ట్వీన్-20తో రెండుసార్లు కడగాలి.అప్పుడు సెల్ లైసేట్‌లను అయస్కాంత పూసలతో 4 గంటలు 4 ° C వద్ద దిగువ నుండి పైకి భ్రమణంతో పొదిగించారు.అప్పుడు పూసలను 1 ml PBST బఫర్‌తో నాలుగు సార్లు కడిగి, 95 ° C వద్ద 5 నిమిషాలు ఉడకబెట్టారు.SDS-PAGE జెల్‌లపై నమూనాలు విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు ప్రామాణిక వెస్ట్రన్ బ్లాట్ పద్ధతులను ఉపయోగించి PVDF పొరలకు బదిలీ చేయబడ్డాయి.TBSTలో 5% స్కిమ్ మిల్క్‌లో పొరలు నిరోధించబడ్డాయి మరియు ప్రైమరీ మరియు సెకండరీ యాంటీబాడీస్‌తో వరుసగా పొదిగేవి.ప్రైమరీ యాంటీబాడీ రాబిట్ యాంటీ SFPQ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ (CST, #71992) TBSTలో 5% స్కిమ్ మిల్క్‌లో 1:1000 నిష్పత్తిలో ఉపయోగించబడింది మరియు రాత్రిపూట 4°C వద్ద పొదిగేది.యాంటీ-రాబిట్ IgG 1:5000 నిష్పత్తిలో ఉపయోగించబడింది మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు పొదిగేది.కెమిడోక్ MP ఇమేజింగ్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి కెమిలుమినిసెన్స్ ద్వారా పొరలు దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.
సాల్వెంట్ యాక్సెస్ చేయగల సర్ఫేస్ ఏరియా (SASA) విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించే అన్ని నిర్మాణాలు ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్ (PDB) 52 లేదా ఆల్ఫాఫోల్డ్ ప్రోటీన్ స్ట్రక్చర్ డేటాబేస్ 53 నుండి పొందబడ్డాయి.FreeSASA ప్రోగ్రామ్‌ని ఉపయోగించి ప్రతి అవశేషానికి సంపూర్ణ SASA లెక్కించబడుతుంది.లేబుల్ చేయబడిన హిస్టిడిన్ మరియు దాని పొరుగువారి కోసం పూర్తి మరియు స్పష్టమైన SASA డేటా మాత్రమే ప్రతి నిర్మాణానికి సగటు SASAని పొందేందుకు ఉపయోగించబడింది.ప్రతి హిస్టిడిన్‌కు సంబంధించిన సాపేక్ష సాల్వెంట్ యాక్సెస్బిలిటీ (RSA) సంపూర్ణ SASA విలువను ద్రావణికి అందుబాటులో ఉన్న అనుభావిక గరిష్ట అవశేష ఉపరితల వైశాల్యం ద్వారా విభజించడం ద్వారా లెక్కించబడుతుంది.సగటు RSA 20% కంటే తక్కువగా ఉంటే అన్ని హిస్టిడైన్‌లు దాచబడినవిగా వర్గీకరించబడతాయి, లేకుంటే బహిర్గతమవుతుంది56.
DDA మోడ్‌లో పొందిన ముడి ఫైల్‌లను ప్రోటీమ్ డిస్కవర్ (v2.5) లేదా MSfragger (Fragpipe v15.0) ఉపయోగించి సముచితమైన SwissProt ధృవీకరించబడిన ప్రోటీన్ డేటాబేస్‌లో సాధారణ కలుషితాలు ఉన్నాయి.పెప్టైడ్‌లకు రెండు తప్పిపోయిన క్లీవేజ్ సైట్‌లతో పూర్తి ట్రిప్సిన్ అవసరం, స్థిర మార్పుగా కార్బమోయిల్ మిథైలేషన్ మరియు డైనమిక్ సవరణగా మెథియోనిన్ ఆక్సీకరణ.పూర్వగామి మరియు ఫ్రాగ్మెంట్ వెయిట్ టాలరెన్స్‌లు వరుసగా 10 ppm మరియు 0.02 Da (MS2 ఆర్బిట్రాప్)కి సెట్ చేయబడ్డాయి. కలుషిత హిట్‌లు తీసివేయబడ్డాయి మరియు <1% తప్పుడు డిస్కవరీ రేటును పొందేందుకు ప్రోటీన్‌లు ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి. కలుషిత హిట్‌లు తీసివేయబడ్డాయి మరియు <1% తప్పుడు డిస్కవరీ రేటును పొందేందుకు ప్రోటీన్‌లు ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి. <br><br><br><br><br> కలుషిత హిట్‌లు తీసివేయబడ్డాయి మరియు <1% తప్పుడు గుర్తింపు రేటును అందించడానికి ప్రోటీన్‌లు ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 పోపాడానియ జాగ్రజ్నియాయుషిచ్ వెస్టవ్ బైలీ ఉడలేన్, ఎ బెల్కీ ఓటిఫిల్ట్రోవన్ టు డే డోస్టిజెనియ యూరోబ్నియా 1 కలుషిత హిట్‌లు తీసివేయబడ్డాయి మరియు <1% తప్పుడు సానుకూల రేటును సాధించడానికి ప్రోటీన్‌లు ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి.లేబుల్‌లను ఉపయోగించకుండా పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం, మూడు బయోలాజికల్ రిపీట్‌ల నుండి సాధారణీకరించిన ప్రోటీన్ కంటెంట్ ఉపయోగించబడింది.DAVID బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ రిసోర్సెస్, MitoCarta 3.0 నుండి జీన్ ఒంటాలజీ (GO) విశ్లేషణ మరియు ఆలిస్ టింగ్ గ్రూప్ ద్వారా సంకలనం చేయబడిన మరియు ప్రచురించబడిన డేటాబేస్‌లను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ సబ్‌సెల్యులర్ స్థానికీకరణ విశ్లేషణ జరిగింది.అగ్నిపర్వత పటం పెర్సియస్ నుండి పొందబడింది (v1.6.15.0). రెండు-వైపుల t-పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక ప్రాముఖ్యత కోసం ప్రోటీన్ సమృద్ధి మడత మార్పులు పరీక్షించబడ్డాయి మరియు ప్రోటీన్ హిట్‌లు సమృద్ధిగా మార్పు >2 (లేకపోతే పేర్కొనకపోతే) మరియు p విలువ <0.05తో గుర్తించబడ్డాయి. రెండు-వైపుల t-పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక ప్రాముఖ్యత కోసం ప్రోటీన్ సమృద్ధి మడత మార్పులు పరీక్షించబడ్డాయి మరియు ప్రోటీన్ హిట్‌లు సమృద్ధిగా మార్పు >2 (లేకపోతే పేర్కొనకపోతే) మరియు p విలువ <0.05తో గుర్తించబడ్డాయి. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. టూ-టెయిల్డ్ టి-టెస్ట్‌ని ఉపయోగించి గణాంక ప్రాముఖ్యత కోసం ప్రోటీన్ కంటెంట్ ఫోల్డ్ మార్పులు పరీక్షించబడ్డాయి మరియు కంటెంట్ మార్పు >2 (లేకపోతే) మరియు ap విలువ <0.05తో ప్రోటీన్ మ్యాచ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి.使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 变化 的 统计 统计 显着性 并 确定 确定 蛋白质 命 中 丰度 变化 变化 变化> 2 （除非 另 有 说明）） 和 p 值 <0.05。使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 倍 变化 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 蛋白质 命 中 的 变化 变化 变化 变化> 2 （另 有 有 说明 和 和 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. ప్రోటీన్ కంటెంట్‌లో రెట్లు మార్పుల యొక్క గణాంక ప్రాముఖ్యత రెండు-తోక గల t- పరీక్షను ఉపయోగించి పరీక్షించబడింది మరియు కంటెంట్ మార్పులు >2 (సూచించకపోతే) మరియు p-విలువలు <0.05 కోసం ప్రోటీన్ మ్యాచ్‌లు నిర్ణయించబడ్డాయి.స్ట్రింగ్ డేటాబేస్‌తో పాటు GO విశ్లేషణను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్ విశ్లేషణ జరిగింది.
ఇలాంటి ఫలితాలతో మూడు జీవ ప్రతిరూపాలు జరిగాయి.గ్రాప్‌ప్యాడ్ ప్రిజం (గ్రాప్‌ప్యాడ్ సాఫ్ట్‌వేర్)తో గణాంక విశ్లేషణ జరిగింది మరియు పెర్సియస్ (v1.6.15.0)తో అగ్నిపర్వత ప్లాట్లు రూపొందించబడ్డాయి.రెండు సమూహాలను పోల్చడానికి, p-విలువలు రెండు-తోక గల విద్యార్థుల t-పరీక్షను ఉపయోగించి నిర్ణయించబడ్డాయి.ప్రయోగాత్మక సమూహంలో కనీసం రెండుసార్లు గుర్తించబడిన సింగిల్టన్ ప్రోటీన్లు మాత్రమే అగ్నిపర్వత ప్లాట్లలో చేర్చబడ్డాయి మరియు నియంత్రణ సమూహంలోని సంబంధిత తప్పిపోయిన విలువలు సాధారణ పంపిణీ నుండి పెర్సియస్‌తో భర్తీ చేయబడ్డాయి, తద్వారా p-విలువను లెక్కించవచ్చు.లోపం పట్టీలు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.గణాంక విశ్లేషణ కోసం ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణలలో, కనీసం రెండు జీవ ప్రతిరూపాలలో కనిపించే ప్రోటీన్ల సమృద్ధి అలాగే ఉంచబడింది.నమూనా పరిమాణాన్ని ముందుగా నిర్ణయించడానికి గణాంక పద్ధతులు ఉపయోగించబడలేదు.ప్రయోగాలు యాదృచ్ఛికంగా లేవు.ప్రయోగం మరియు ఫలితాల మూల్యాంకనం సమయంలో పరిశోధకులు పనుల పట్ల గుడ్డిగా లేరు.
అధ్యయన రూపకల్పనపై మరింత సమాచారం కోసం, ఈ కథనానికి లింక్ చేయబడిన ప్రకృతి పరిశోధన నివేదిక సారాంశాన్ని చూడండి.
ఈ అధ్యయనంలో పొందిన మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ డేటా డేటాసెట్ ID PXD034811 (PDPL-MS డేటాసెట్) క్రింద iProX57 భాగస్వామి రిపోజిటరీ ద్వారా ప్రోటీమ్ ఎక్స్ఛేంజ్ కన్సార్టియంకు సమర్పించబడింది.ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.ఈ కథనం అసలు డేటాను అందిస్తుంది.
జింగ్రాస్, AC, అబే, KT & రాట్, B. పొరుగు ప్రాంతాలను తెలుసుకోవడం: ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు మ్యాప్ ఆర్గానెల్స్‌ను వర్గీకరించడానికి సామీప్య-ఆధారిత బయోటైనిలేషన్‌ను ఉపయోగించడం. జింగ్రాస్, AC, అబే, KT & రాట్, B. పొరుగు ప్రాంతాలను తెలుసుకోవడం: ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు మ్యాప్ ఆర్గానెల్స్‌ను వర్గీకరించడానికి సామీప్య-ఆధారిత బయోటైనిలేషన్‌ను ఉపయోగించడం.జింగ్రాస్, AS, అబే, KT మరియు రౌట్, B. పరిసరాలతో పరిచయం: ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లు మరియు మ్యాప్ ఆర్గానెల్స్‌ను వర్గీకరించడానికి సామీప్య-ఆధారిత బయోటైనిలేషన్‌ను ఉపయోగించడం. గింగ్రాస్, AC, అబే, KT & రౌట్, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. పొరుగున అర్థం చేసుకోవడం: జీవసంబంధమైన జీవితంపై పొరుగువారి ఆధారపడటాన్ని ఉపయోగించండి.జింగ్రాస్, AS, అబే, KT మరియు రౌత్, B. సామీప్యతను అర్థం చేసుకోవడం: ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల క్యారెక్టరైజేషన్ మరియు సామీప్య-ఆధారిత బయోటైనిలేషన్‌ని ఉపయోగించి ఆర్గానిల్స్ మ్యాపింగ్.ప్రస్తుత.నా అభిప్రాయం.రసాయన.జీవశాస్త్రం 48, 44–54 (2019).
గెరీ, JB మరియు ఇతరులు.రోగనిరోధక కణాలకు డెక్స్టర్ శక్తిని బదిలీ చేయడం ద్వారా సూక్ష్మ పర్యావరణాన్ని మ్యాపింగ్ చేయడం.సైన్స్ 367, 1091–1097 (2020).
హెర్ట్లింగ్, EL మరియు ఇతరులు.రెండు-ప్రోటీమ్ స్కేల్ నెట్‌వర్క్‌లు మానవ ఇంటరాక్టోమ్ యొక్క సెల్-నిర్దిష్ట పునర్నిర్మాణాన్ని గుర్తిస్తాయి.సెల్‌లు 184, 3022–3040.e3028 (2021).