వార్తలు

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ సంస్కరణకు పరిమిత CSS మద్దతు ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).ఈ సమయంలో, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా రెండర్ చేస్తాము.
క్యాన్సర్ కణాలు సెల్యులార్ ఒత్తిడిని అధిగమించడానికి మరియు పురోగతిని కొనసాగించడానికి వివిధ యంత్రాంగాలను అభివృద్ధి చేశాయి.ప్రోటీన్ కినేస్ R (PKR) మరియు దాని ప్రోటీన్ యాక్టివేటర్ (PACT) ప్రారంభ ప్రతిస్పందనదారులు, ఇవి కణాల విస్తరణ మరియు అపోప్టోసిస్ యొక్క నిరోధానికి దారితీసే వివిధ ఒత్తిడి సంకేతాలను పర్యవేక్షిస్తాయి.అయినప్పటికీ, క్యాన్సర్ కణాలలో PACT-PKR మార్గం యొక్క నియంత్రణ ఎక్కువగా తెలియదు.ఇక్కడ, లాంగ్ నాన్-కోడింగ్ RNA (lncRNA) అస్పార్టైల్ tRNA సింథటేస్ యాంటిసెన్స్ RNA 1 (DARS-AS1) నేరుగా PACT-PKR మార్గం యొక్క నిరోధంలో పాల్గొంటుందని మరియు క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుందని మేము కనుగొన్నాము.CRISPRi 971 క్యాన్సర్-అనుబంధ lncRNA యొక్క పెద్ద-స్థాయి ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్‌ను ఉపయోగించి, DARS-AS1 గణనీయంగా మెరుగుపరచబడిన క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణతో సంబంధం కలిగి ఉందని మేము కనుగొన్నాము.అందువల్ల, DARS-AS1 నాకౌట్ కణాల విస్తరణను నిరోధిస్తుంది మరియు విట్రోలోని వివిధ క్యాన్సర్ కణ తంతువులలో క్యాన్సర్ కణ అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది మరియు వివోలో కణితి పెరుగుదలను గణనీయంగా తగ్గిస్తుంది.యాంత్రికంగా, DARS-AS1 నేరుగా PACT యాక్టివేషన్ డొమైన్‌తో బంధిస్తుంది మరియు PACT-PKR పరస్పర చర్యను నిరోధిస్తుంది, తద్వారా PKR యాక్టివేషన్, eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను తగ్గిస్తుంది మరియు అపోప్టోటిక్ సెల్ డెత్‌ను నిరోధిస్తుంది.వైద్యపరంగా, DARS-AS1 బహుళ క్యాన్సర్‌లలో విస్తృతంగా వ్యక్తీకరించబడింది మరియు ఈ lncRNA యొక్క అతిగా ఎక్స్‌ప్రెషన్ పేలవమైన రోగ నిరూపణను సూచిస్తుంది.ఈ అధ్యయనం DARS-AS1 lncRNA ద్వారా PACT-PKR మార్గం యొక్క క్యాన్సర్-నిర్దిష్ట నియంత్రణను వివరిస్తుంది మరియు క్యాన్సర్ రోగ నిరూపణ మరియు చికిత్స కోసం మరొక లక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది.
ఒత్తిడికి అనుగుణంగా ఉండే సామర్థ్యం క్యాన్సర్ కణాల మనుగడ మరియు విస్తరణ యొక్క ముఖ్యమైన లక్షణం.క్యాన్సర్ యొక్క వేగవంతమైన విస్తరణ మరియు జీవక్రియ లక్షణాలు కఠినమైన సూక్ష్మ వాతావరణాలలో-పోషక లేమి, హైపోక్సియా మరియు తక్కువ pH-లో గరిష్ట స్థాయికి చేరుకుంటాయి, ఇవి సెల్ డెత్ సిగ్నలింగ్ మార్గాలను ప్రేరేపించగలవు.p535, హీట్ షాక్ ప్రోటీన్లు 6, 7, KRAS8, 9, మరియు HIF-110, 11, 12, 13 వంటి ఒత్తిడి-సెన్సిటివ్ జన్యువుల క్రమబద్ధీకరణ క్యాన్సర్‌లో తరచుగా గమనించబడుతుంది, తద్వారా అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధించడం మరియు మనుగడను ప్రోత్సహిస్తుంది.
ప్రోటీన్ కినేస్ R (PKR) అనేది ఒక ముఖ్యమైన స్ట్రెస్ సెన్సార్ మరియు యూకారియోటిక్ ఇనిషియేషన్ ఫ్యాక్టర్ 2α (eIF2α) యొక్క సబ్‌యూనిట్ కినేస్, ఇది సెల్యులార్ ఒత్తిడిని సెల్ డెత్‌కి లింక్ చేసే ట్రాన్స్‌లేషన్ రెగ్యులేటర్.విదేశీ డబుల్ స్ట్రాండెడ్ RNA (dsRNA)ని గుర్తించడం ద్వారా PKR నిజానికి యాంటీవైరల్ ప్రోటీన్‌గా గుర్తించబడింది.క్రియాశీలత తర్వాత, PKR వైరల్ మరియు సెల్యులార్ ప్రోటీన్ సంశ్లేషణను నిరోధించడానికి eIF2αని ఫాస్ఫోరైలేట్ చేస్తుంది14,15,16.dsRNA17,18,19,20,21,22,23 లేనప్పుడు PACT (PKR యాక్టివేటర్ ప్రోటీన్) మొదటి PKR యాక్టివేటర్ ప్రోటీన్‌గా గుర్తించబడింది.PKRతో ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్య ద్వారా, PACT వివిధ ఒత్తిళ్లను (సీరం ఆకలి, పెరాక్సైడ్ లేదా ఆర్సెనైట్ చికిత్స) PKR మరియు దిగువ సిగ్నలింగ్ మార్గాలకు ప్రసారం చేస్తుంది.eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్‌తో పాటు, PACT-మధ్యవర్తిత్వ PKR యాక్టివేషన్ ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనతో అనుబంధించబడిన వివిధ ఈవెంట్‌లను ప్రేరేపిస్తుంది, PI3K/Akt24 మార్గం ద్వారా మార్చబడిన రెడాక్స్ స్థితి, p5325,26 ద్వారా మెరుగుపరచబడిన DNA నష్టం తనిఖీ మరియు NF-κB27,28, 29 ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ని నియంత్రిస్తుంది. ఒత్తిడి ప్రతిస్పందన, విస్తరణ, అపోప్టోసిస్ మరియు ఇతర కీలకమైన సెల్యులార్ ప్రక్రియలలో వారి కీలక పాత్ర కారణంగా, PKR మరియు PACT అనేక వ్యాధులకు, ముఖ్యంగా క్యాన్సర్30,31,32,33కి చికిత్సా లక్ష్యాలను వాగ్దానం చేస్తున్నాయి.అయినప్పటికీ, ఈ ప్లియోట్రోపిక్ ఫంక్షనల్ మరియు బయోలాజికల్ ప్రాముఖ్యత ఉన్నప్పటికీ, క్యాన్సర్ కణాలలో PACT/PKR కార్యకలాపాల నియంత్రణ అస్పష్టంగానే ఉంది.
lncRNAలు ప్రోటీన్-కోడింగ్ సంభావ్యత లేని 200 న్యూక్లియోటైడ్‌ల కంటే పెద్ద ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌లు.అత్యాధునిక మొత్తం జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ ప్రాజెక్ట్‌లు వేలకొద్దీ lncRNAలను గుర్తించినందున, వాటి జీవసంబంధమైన విధులను వివరించడానికి 35,36 చాలా ప్రయత్నాలు జరిగాయి.X-క్రోమోజోమ్ ఇన్‌యాక్టివేషన్38,39, ముద్రణ40, ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్41,42, ట్రాన్స్‌లేషన్43 మరియు క్యాన్సర్ పెరుగుదల44,45,46,47 నియంత్రణతో సహా అనేక జీవ ప్రక్రియలలో lncRNAలు పాల్గొంటున్నాయని పెరుగుతున్న పరిశోధనా విభాగం చూపించింది.ఈ అధ్యయనాలు అనేక lncRNAలు PACT/PKR మార్గంలో పాలుపంచుకున్నాయని నివేదించాయి.అలాంటి ఒక అధ్యయనం lncRNA ASPACT PACT ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను నిరోధించిందని మరియు PACT mRNA యొక్క అణు నిలుపుదలని పెంచిందని చూపించింది.ఇతర అధ్యయనాలు lncRNA nc886 PKRతో బంధిస్తుంది మరియు దాని ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను నిరోధిస్తుంది49,50.ఇప్పటివరకు, PACT-మధ్యవర్తిత్వ PKR యాక్టివేషన్‌ని నియంత్రించే lncRNA నివేదించబడలేదు.
Aspartyl-tRNA సింథటేస్ యాంటిసెన్స్ RNA 1 (DARS-AS1) ఒక ఆంకోజెనిక్ lncRNA51,52,53,54గా గుర్తించబడింది.miP-194-5p53, miP-12952 మరియు miP-532-3p51 యొక్క నియంత్రణ ద్వారా, DARS-AS1 వరుసగా స్పష్టమైన కణ మూత్రపిండ కణ క్యాన్సర్, థైరాయిడ్ కార్సినోమా మరియు నాన్-స్మాల్ సెల్ లంగ్ కార్సినోమా పెరుగుదలను ప్రోత్సహిస్తుందని చూపబడింది.ప్రోటీన్ 39 (RBM39) RNA-బైండింగ్ మూలాంశం యొక్క స్థిరత్వాన్ని నిర్వహించడం ద్వారా DARS-AS1 మైలోమా పురోగతిని ప్రోత్సహిస్తుందని టోంగ్ మరియు సహచరులు కనుగొన్నారు.అయినప్పటికీ, ఈ lncRNA PACT-PKR యాక్టివేషన్ మరియు క్యాన్సర్ కణాల ఒత్తిడి ప్రతిస్పందన యొక్క నియంత్రణలో పాల్గొంటుందా లేదా అనే దానిపై ఎటువంటి అధ్యయనాలు నిర్వహించబడలేదు.
ఇక్కడ, మేము CRISPRi సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి పెద్ద-స్థాయి లాస్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ స్క్రీన్‌ను ప్రదర్శించాము మరియు DARS-AS1 lncRNA అనేక రకాల క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుందని నిర్ధారించాము.అదనంగా, మేము ఒక ప్రధాన యంత్రాంగాన్ని గుర్తించాము: DARS-AS1 నేరుగా PACTతో బంధిస్తుంది, PACT మరియు PKR బైండింగ్‌లను నిరోధిస్తుంది, తక్కువ PKR సబ్‌స్ట్రేట్ అయిన eIF2α యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను నిరోధిస్తుంది మరియు చివరికి అపోప్టోటిక్ సెల్ డెత్‌ను నిరోధిస్తుంది.ముగింపులో, మా పని DARS-AS1 lncRNAని PACT-PKR మార్గం యొక్క నియంత్రకంగా మరియు క్యాన్సర్ చికిత్స మరియు రోగ నిరూపణకు సంభావ్య లక్ష్యంగా వెల్లడిస్తుంది.
విస్తృతమైన జెనోమిక్ ప్రొఫైలింగ్ అధ్యయనాలు క్యాన్సర్‌తో సంబంధం ఉన్న వందలాది lncRNAలను గుర్తించాయి.అయినప్పటికీ, వాటి పనితీరు ఎక్కువగా తెలియదు56.క్యాన్సర్ పురోగతిలో పాల్గొన్న మంచి lncRNA అభ్యర్థులను గుర్తించడానికి, మేము CRISPRi సిస్టమ్ (Fig. 1a) ఉపయోగించి SW620 కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్‌లో తగ్గిన విస్తరణ కోసం లాస్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ స్క్రీన్‌ను ప్రదర్శించాము.SW480 మరియు SW620 పెద్దప్రేగు క్యాన్సర్ కణ తంతువుల యొక్క ప్రత్యేక లక్షణం ఏమిటంటే అవి ఒకే రోగిలోని ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ కణితుల నుండి ఉద్భవించాయి.అధునాతన పెద్దప్రేగు క్యాన్సర్ యొక్క పురోగతిలో జన్యు మార్పులను అధ్యయనం చేయడానికి ఇది విలువైన పోలికను అందిస్తుంది.అందువల్ల, మేము RNA సీక్వెన్సింగ్‌ను ఉపయోగించి కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్‌ల (SW480 మరియు SW620) ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లను విశ్లేషించాము మరియు ప్రచురించిన సాహిత్యం నుండి కొన్ని సంభావ్య ఫంక్షనల్ lncRNA లను సేకరించాము.ఈ ఫలితాల ఆధారంగా, మేము 971 క్యాన్సర్-సంబంధిత lncRNAలను లక్ష్యంగా చేసుకుని 7355 sgRNA ఒలిగోలు మరియు ప్రతికూల నియంత్రణ కోసం 500 లక్ష్యం లేని sgRNA ఒలిగోలను కలిగి ఉన్న పూల్ చేయబడిన sgRNA లైబ్రరీని రూపొందించాము (సప్లిమెంటరీ డేటా 1).
CRISPRi వ్యవస్థను ఉపయోగించి స్క్రీనింగ్ యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం.స్క్రీనింగ్ తర్వాత b sgRNA సుసంపన్నం.క్షితిజ సమాంతర చుక్కల రేఖ లాగ్2 (రెట్లు మార్పు) = ±0.58ని సూచిస్తుంది.నిలువు చుక్కల పంక్తి p విలువ = 0.05ని సూచిస్తుంది.నల్ల చుక్కలు లక్ష్యం కాని sgRNA ని సూచిస్తాయి (NCగా నియమించబడినవి).ఎరుపు చుక్కలు DARS-AS1ని లక్ష్యంగా చేసుకునే sgRNAలు.నీలి చుక్కలు LINC00205 లక్ష్యంగా sgRNAలు, గతంలో వివరించిన ఆంకోజెనిక్ lncRNA.రెట్లు మార్పు = (సాధారణీకరించిన పఠనం, రోజు 17)/(సాధారణ పఠనం, రోజు 0).c DARS-AS1 sgRNA నాక్‌డౌన్ కణాల పెరుగుదలను నిరోధించింది.ఎర్రర్ బార్‌లు మూడు ప్రయోగాల యొక్క ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్.d DARS-AS1 కణితుల్లో వ్యక్తీకరణ (TCGA డేటాసెట్).em వరుసగా BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP మరియు COAD (TCGA డేటాసెట్) ఉన్న రోగుల నుండి జత చేసిన సాధారణ మరియు కణితి నమూనాలలో DARS-AS1 యొక్క వ్యక్తీకరణ.జత చేసిన టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ ఉపయోగించి p-విలువలు పొందబడ్డాయి.
ప్లాస్మిడ్‌ను నిర్మించి, లెంటివైరస్‌ని ప్యాకేజింగ్ చేసిన తర్వాత, మేము నాలుగు స్వతంత్ర ఇన్‌ఫెక్షన్ ప్రయోగాలలో పై లైబ్రరీతో dCas9-SW620 కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్‌ను ప్రసారం చేసాము.ఈ ఇన్ఫెక్షన్‌ల కోసం ఇన్‌ఫెక్షన్ యొక్క గుణకారం (MOI) 0.1–0.3, ఇది ప్రతి కణం ఒక sgRNAతో మాత్రమే బదిలీ చేయబడుతుందని సూచిస్తుంది.18 రోజుల ఇన్ విట్రో కల్చర్ తర్వాత, స్క్రీనింగ్ తర్వాత టార్గెట్ sgRNAల సుసంపన్నత ప్రొఫైల్ తగ్గింది లేదా పెరిగింది, అయితే లక్ష్యం కాని కంట్రోల్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల సంఖ్య ప్రీ-స్క్రీనింగ్ ప్రొఫైల్‌తో పోలిస్తే సాపేక్షంగా మారలేదు, ఇది మా లక్ష్యం చాలా స్క్రీన్-నిర్దిష్టంగా ఉందని సూచిస్తుంది. గ్రంధాలయం.అన్నం.1b మరియు అనుబంధ పట్టిక 1). LINC00205, ఊపిరితిత్తుల క్యాన్సర్ మరియు కాలేయ క్యాన్సర్ పురోగతి58,59,60ని ప్రోత్సహించడానికి గతంలో నివేదించబడింది, ఈ స్క్రీనింగ్ యొక్క విశ్వసనీయతను నిర్ధారిస్తూ (లాగ్2 (ఫోల్డ్‌చేంజ్) <−0.58, p విలువ <0.05) పరీక్షించబడింది (Fig. 1b). LINC00205, ఊపిరితిత్తుల క్యాన్సర్ మరియు కాలేయ క్యాన్సర్ పురోగతి58,59,60ని ప్రోత్సహించడానికి గతంలో నివేదించబడింది, ఈ స్క్రీనింగ్ యొక్క విశ్వసనీయతను నిర్ధారిస్తూ (లాగ్2 (ఫోల్డ్‌చేంజ్) <−0.58, p విలువ <0.05) పరీక్షించబడింది (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, ఊపిరితిత్తుల క్యాన్సర్ మరియు కాలేయ క్యాన్సర్58,59,60 యొక్క పురోగతిని ప్రోత్సహించడానికి గతంలో నివేదించబడింది, మినహాయించబడింది (లాగ్2 (రెట్లు మార్పు) <-0.58, p-విలువ <0.05), ఈ స్క్రీనింగ్ యొక్క పటిష్టతను నిర్ధారిస్తుంది (Fig. .1b) . LINC00205 LINC00205 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, ఊపిరితిత్తుల మరియు కాలేయ క్యాన్సర్ పురోగతిని ప్రోత్సహించడానికి గతంలో నివేదించబడింది58,59,60, మినహాయించబడింది (లాగ్2 (రెట్లు మార్పు) <-0.58, p-విలువ <0.05), ఈ స్క్రీనింగ్ యొక్క పటిష్టతను నిర్ధారిస్తుంది (Fig. .1b).
పరీక్షించిన అన్ని lncRNAలలో, DARS-AS1 కూడా పరీక్షించబడింది, 18 రోజుల సంస్కృతి తర్వాత మూడు కాగ్నేట్ sgRNA ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లు గణనీయంగా తగ్గాయి, ఈ lncRNA యొక్క నాక్‌డౌన్ ఫలితంగా క్యాన్సర్ విస్తరణ తగ్గిందని సూచిస్తుంది (Fig. 1b).నియంత్రణ కణాలతో (మూర్తి 1 సి) పోల్చితే DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ కణాల వృద్ధి రేటు సగానికి తగ్గిందని మరియు అనేక ఇతర క్యాన్సర్ రకాల మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉందని చూపించే కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ కణాలలో MTS విశ్లేషణ ఈ ఫలితానికి మరింత మద్దతు ఇచ్చింది.: క్లియర్ సెల్ కిడ్నీ క్యాన్సర్, థైరాయిడ్ క్యాన్సర్ మరియు నాన్-స్మాల్ సెల్ ఊపిరితిత్తుల క్యాన్సర్51,52,53,55.అయినప్పటికీ, కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్‌లో దాని పనితీరు మరియు పరమాణు విధానాలు అన్వేషించబడలేదు.కాబట్టి, తదుపరి అధ్యయనం కోసం మేము ఈ lncRNAని ఎంచుకున్నాము.
రోగులలో DARS-AS1 వ్యక్తీకరణను అధ్యయనం చేయడానికి, మేము క్యాన్సర్ జీనోమ్ అట్లాస్ (TCGA) ప్రాజెక్ట్ నుండి 10,327 కణితి నమూనాలను సమగ్రంగా విశ్లేషించాము.పెద్దప్రేగు అడెనోకార్సినోమా (COAD), మూత్రపిండ క్లియర్ సెల్ కార్సినోమా (KIRC) మరియు మూత్రపిండ పాపిల్లరీ సెల్ కార్సినోమా (KIRP) సహా వివిధ రకాల కణితుల్లోని ఆరోగ్యకరమైన కణాలలో DARS-AS1 విస్తృతంగా వ్యక్తీకరించబడిందని మరియు గణనీయంగా నియంత్రించబడిందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి..చాలా తక్కువ (Fig. 1d మరియు అనుబంధ Fig. 1a, b). జత చేసిన ఆరోగ్యకరమైన/కణితి నమూనాల విశ్లేషణ మూత్రాశయ యూరోథెలియల్ కార్సినోమా (BLCA), కిడ్నీ మూత్రపిండ క్లియర్ సెల్ కార్సినోమా (KIRC), ప్రోస్టేట్ అడెనోకార్సినోమా (PRAD), ఊపిరితిత్తుల పొలుసుల కణ క్యాన్సర్ (LUSC) కణితుల్లో DARS-AS1 యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను మరింతగా నిర్ధారించింది. , గర్భాశయ కార్పస్ ఎండోమెట్రియల్ కార్సినోమా (UCEC), ఊపిరితిత్తుల అడెనోకార్సినోమా (LUAD), లివర్ హెపాటోసెల్యులర్ కార్సినోమా (LIHC), కిడ్నీ మూత్రపిండ పాపిల్లరీ సెల్ కార్సినోమా (KIRP), మరియు కోలన్ అడెనోకార్సినోమా (COAD) (p విలువ <0.05) (Fig. 1e-m) . జత చేసిన ఆరోగ్యకరమైన/కణితి నమూనాల విశ్లేషణ మూత్రాశయ యూరోథెలియల్ కార్సినోమా (BLCA), కిడ్నీ మూత్రపిండ క్లియర్ సెల్ కార్సినోమా (KIRC), ప్రోస్టేట్ అడెనోకార్సినోమా (PRAD), ఊపిరితిత్తుల పొలుసుల కణ క్యాన్సర్ (LUSC) కణితుల్లో DARS-AS1 యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను మరింతగా నిర్ధారించింది. , గర్భాశయ కార్పస్ ఎండోమెట్రియల్ కార్సినోమా (UCEC), ఊపిరితిత్తుల అడెనోకార్సినోమా (LUAD), లివర్ హెపాటోసెల్యులర్ కార్సినోమా (LIHC), కిడ్నీ మూత్రపిండ పాపిల్లరీ సెల్ కార్సినోమా (KIRP), మరియు కోలన్ అడెనోకార్సినోమా (COAD) (p విలువ <0.05) (Fig. 1e-m) .జత చేసిన ఆరోగ్యకరమైన/కణితి నమూనాల విశ్లేషణ కూడా మూత్రాశయ యూరోథెలియల్ కార్సినోమా (BLCA), స్పష్టమైన కణ మూత్రపిండ మరియు మూత్రపిండ కణ క్యాన్సర్ (KIRC), ప్రోస్టేట్ అడెనోకార్సినోమా (PRAD), ఊపిరితిత్తుల పొలుసుల కణ క్యాన్సర్ (LUSC) కణితుల్లో DARS-AS1 యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను నిర్ధారించింది., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , కార్పస్ గర్భాశయం యొక్క ఎండోమెట్రియల్ కార్సినోమా (UCEC), ఊపిరితిత్తుల అడెనోకార్సినోమా (LUAD), కాలేయం యొక్క హెపాటోసెల్యులర్ కార్సినోమా (LIHC), పాపిల్లరీ సెల్ కార్సినోమా ఆఫ్ ది కిడ్నీ (KIRP), మరియు పెద్దప్రేగు యొక్క అడెనోకార్సినోమా (COAD) (p విలువ < 0.05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 分析 进一步 证实 了 了 了 dars-as1 在 尿路 上 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 细胞癌 细胞癌 、 、 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (ప్రాడ్) 、 、 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 (lusc) 肿瘤 中 中 的 的 的显着 更 更 高 ， ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（ucec） ， 肺腺癌 （（luad） ， 肝肝 细胞癌 （（lihc） ， 肾 乳头状 细胞癌 细胞癌 （（（（） 和结肠腺癌 （（coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .) .癌 (కిర్ప్) (కోడ్) (పి 值<0.05）)ఆరోగ్యకరమైన/కణితి జత చేసిన నమూనాల విశ్లేషణ మూత్రాశయ యూరోథెలియల్ కార్సినోమా (BLCA), క్లియర్ సెల్ మూత్రపిండ కణ క్యాన్సర్ (KIRC), ప్రోస్టేట్ అడెనోకార్సినోమా (PRAD) మరియు ఊపిరితిత్తుల పొలుసుల కణ క్యాన్సర్ (LUSC) కణితుల్లో DARS-AS1 పాత్రకు మరింత మద్దతునిచ్చింది.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). కార్పస్ యుటెరైన్ కార్సినోమా (UCEC), ఊపిరితిత్తుల అడెనోకార్సినోమా (LUAD), హెపాటోసెల్యులర్ కార్సినోమా (LIHC), మూత్రపిండ పాపిల్లరీ సెల్ కార్సినోమా (KIRP), మరియు కోలన్ అడెనోకార్సినోమా (COAD) (p విలువ <0.05) (Figure 1e -m).కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 వివిధ రకాల క్యాన్సర్‌లలో విస్తృతంగా మరియు ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడిందని సూచిస్తున్నాయి.
DARS-AS1 మరియు DARS (యాంటిసెన్స్ స్ట్రాండ్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యువు) ఒకే ప్రమోటర్‌ను పంచుకోవడం మరియు ఒకదానికొకటి పక్కన ఉన్నందున, మేము ప్రత్యేకంగా DARS-AS1ని నాక్‌డౌన్ చేయడానికి shRNAని రూపొందించాము కానీ DARS కాదు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2a,b మరియు అనుబంధ పట్టిక 2 ) .SW620తో పాటు, shRNA నాక్‌డౌన్ (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 3) యొక్క సమర్థత మరియు పనితీరును అధ్యయనం చేయడానికి మేము DARS-AS1ని ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించే మూడు ఇతర సెల్ లైన్‌లను కూడా ఉపయోగించాము.మా ఫలితాలు అభివృద్ధి చేసిన మూడు shRNAలు కనీసం 80% DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ సామర్థ్యాన్ని DARS mRNA (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2c-f) మొత్తంపై తక్కువ ప్రభావంతో సాధించాయని సూచించింది.అదనంగా, ఈ shRNA లతో DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్లు SW620 (49.7%) మరియు HCT116 (27.7%), రొమ్ము క్యాన్సర్ సెల్ లైన్ MBA-MD-231 (53.4%)లలో కణాల పెరుగుదలను గణనీయంగా నిరోధించిందని మేము కనుగొన్నాము.) మరియు HepG2 హెపటోమా కణ రేఖ (92.7% తగ్గింపు), అలాగే అంకర్ చేయని గోళాలను ఏర్పరచగల సామర్థ్యం (సగటు తగ్గింపు ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% మరియు 75.7% ప్రతి సెల్ లైన్) (Fig. 2a,b).SW620లో, కాలనీ ఫార్మేషన్ అస్సే ఫలితాలు DARS-AS1 shRNA గణనీయంగా సుమారుగా 69.6% తగ్గుదలతో కణ విస్తరణను నిరోధిస్తుందని నిర్ధారించింది (Fig. 2c).
SW620, HCT116, MBA-MD-231 మరియు HepG2 కణాలలో సెల్ విస్తరణ (a) మరియు గోళాకార నిర్మాణం (b)పై నియంత్రణ shRNA మరియు DARS-AS1 shRNA ప్రభావం.c SW620 కణాలలో కాలనీ నిర్మాణంపై నియంత్రణ shRNA మరియు DARS-AS1 shRNA ప్రభావం.సెల్ విస్తరణ (d), గోళాకార నిర్మాణం (e), మరియు SW620 కణాల కాలనీ నిర్మాణం (f) DARS-AS1ని అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేస్తుంది.చూపబడిన డేటా మూడు ప్రయోగాల సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, మరియు *** p ≤ 0.001 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t-test ద్వారా.
లాస్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ అధ్యయనాలను పూర్తి చేయడానికి, మేము తర్వాత DARS-AS1 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2g) అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే SW620 సెల్‌లను సృష్టించాము.DARS-AS1 ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ గణనీయంగా SW620 కణాలలో కణాల పెరుగుదల (1.8 రెట్లు), అన్‌యాంకర్డ్ స్పిరోయిడ్ ఫార్మేషన్ (1.4 రెట్లు) మరియు కాలనీ నిర్మాణం (3.3 రెట్లు) పెరిగింది (Fig. 2d-f).మేము ఈ ఫలితాన్ని మరొక DARS-AS1 ఎక్స్‌ప్రెసింగ్ సెల్ లైన్, A549ని ఉపయోగించి నిర్ధారించాము.DARS-AS1 ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ కారణంగా ఈ మెరుగైన సెల్ విస్తరణ A549 కణాలలో మరింతగా గమనించబడింది (అనుబంధ Fig. 2h, i మరియు అనుబంధ పట్టిక 3).కలిసి తీసుకుంటే, ఈ లాభం మరియు నష్ట అధ్యయనాలు DARS-AS1 విట్రోలో క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుందని నిరూపిస్తున్నాయి.
DARS-AS1 కణాల విస్తరణను నియంత్రించే అంతర్లీన యంత్రాంగాన్ని అన్వేషించడానికి, దాని సంభావ్య ప్రోటీన్-బైండింగ్ భాగస్వాములను గుర్తించడానికి మేము RNA పుల్-డౌన్ విశ్లేషణను చేసాము.RT-qPCR ఫలితాలు దాదాపు 86.2% DARS-AS1 SW620 కణాల సైటోప్లాజంలో ఉన్నట్లు చూపించాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3a).ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్టెడ్ బయోటైనిలేటెడ్ DARS-AS1 లేదా pseudoRNA తరువాత SW620 సెల్ లైసేట్‌లతో పొదిగేది, తరువాత SDS-PAGE వేరు చేయబడింది.తదుపరి వెండి మరకలు DARS-AS1 పుల్ శాంపిల్స్‌లో ఒక ప్రత్యేకమైన బ్యాండ్ (~38 kDa) గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉన్నాయని చూపించింది కాని నకిలీ RNA లేదా పూసల నమూనాలలో (Fig. 3a).ఈ బ్యాండ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) ద్వారా PKR యాక్టివేటింగ్ ప్రోటీన్ (PACT)గా గుర్తించబడింది మరియు SW620, HCT116, మరియు HepG2 సెల్ లైన్‌లలో (Fig. 3a,b) ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ ద్వారా మరింత ధృవీకరించబడింది.DARS మరియు సంబంధిత PACT ప్రొటీన్‌ల సుసంపన్నత - PKR మరియు TRBP - వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ (WB) ద్వారా RNA విశ్లేషణను ఉపయోగించి కూడా పరిశోధించబడింది.ఫలితాలు DARS-AS1 RNA మరియు ఈ మూడు ప్రోటీన్‌ల మధ్య ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్య కనుగొనబడలేదు (అనుబంధ Fig. 3b).DARS-AS1 మరియు PACT మధ్య నిర్దిష్ట పరస్పర చర్య RNA ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (RIP) విశ్లేషణ ద్వారా మరింత ధృవీకరించబడింది, ఇది DARS-AS1 యాంటీ-PACT యాంటీబాడీస్‌లో గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉందని చూపించింది కానీ ఇతర నియంత్రణ RNAలు కాదు (మూర్తి 3c).ఇతర సెల్యులార్ భాగాలు లేనప్పుడు DARS-AS1 నేరుగా PACTతో సంకర్షణ చెందుతుందో లేదో తెలుసుకోవడానికి, శుద్ధి చేయబడిన PACTని ఉపయోగించి ఇన్ విట్రో బయోలేయర్ ఇంటర్‌ఫెరోమెట్రీ (BLI) పరీక్ష నిర్వహించబడింది.బయోటిన్-లేబుల్ చేయబడిన DARS-AS1 లేదా డమ్మీ RNA స్ట్రెప్టావిడిన్ (SA) బయోసెన్సర్‌లపై స్థిరీకరించబడింది మరియు తరువాత 1 μM PACT కలిగిన కైనటిక్ బఫర్‌లో పొదిగేది.ముఖ్యంగా, PACT DARS-AS1 (KD విలువ ~26.9 nM)కి బలంగా కట్టుబడి ఉంటుంది, కానీ RNAని అనుకరించడానికి కాదు (మూర్తి 3d).కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 మరియు PACT మధ్య ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్య మరియు అధిక అనుబంధాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి.
RNA పుల్ విశ్లేషణ DARS-AS1 SW620 కణాలలో PACTతో సంకర్షణ చెందుతుందని గుర్తించింది.పైన, సంబంధిత ప్రోటీన్ల వెండి మరక.యాంటీ-పాక్ట్ యాంటీబాడీతో దిగువ ఇమ్యునోబ్లోట్‌లు ప్రదర్శించబడ్డాయి.b RNA పుల్-డౌన్ విశ్లేషణ HCT116 (టాప్) మరియు HepG2 (దిగువ) కణాలలో నిర్వహించబడింది.ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ ద్వారా PACT సుసంపన్నత కనుగొనబడింది.సూచించిన ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి SW620 కణాలలో cRNA ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (RIP) పరీక్షలు జరిగాయి.d బయోలేయర్ ఇంటర్‌ఫెరోమెట్రీ (BLI) ఉపయోగించి పూర్తి-నిడివి గల DARS-AS1 లేదా నియంత్రణ RNAకి PACT బైండింగ్ వక్రతలు పొందబడ్డాయి.స్ట్రెప్టావిడిన్ బయోసెన్సర్‌పై ఆర్‌ఎన్‌ఏ స్థిరీకరించబడింది.అనుబంధాన్ని కొలవడానికి 1 μM PACT ఉపయోగించబడింది.e RNA పుల్ అస్సే బయోటైనిలేటెడ్ పూర్తి-నిడివి DARS-AS1 లేదా కత్తిరించబడిన (పైభాగం) ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.PACT అందుకున్న ఇమ్యునోబ్లోట్ (దిగువ)f శుద్ధి చేయబడిన ఫ్లాగ్ చేయబడిన PACT బయోటైనిలేటెడ్ పూర్తి-పొడవు DARS-AS1తో పొదిగించబడింది లేదా ఇన్ విట్రో RIP పరీక్ష కోసం కత్తిరించబడింది (e లో వలె).సంగ్రహించిన RNA RT-qPCR ద్వారా ధృవీకరించబడింది.g PACT కోసం వివిధ RNA శకలాల సాపేక్ష అనుబంధం బయోలేయర్ ఇంటర్‌ఫెరోమెట్రీని ఉపయోగించి పొందబడింది.విశ్లేషణ కోసం, 100 nM RNA మరియు 1 μM RAST ఉపయోగించబడ్డాయి.h ఇన్ విట్రో RIP పరీక్షలు శుద్ధి చేయబడిన చెక్కుచెదరకుండా లేదా కత్తిరించబడిన PACT లేబుల్ ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి.సంగ్రహించిన RNA RT-qPCR ద్వారా ధృవీకరించబడింది.i DARS-AS1, PACT లేదా రెండింటిని అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే SW620 కణాల పెరుగుదల రేటు.j SW620 కణాలలో పూర్తి-నిడివి లేదా కత్తిరించబడిన DARS-AS1 యొక్క అతిగా ప్రసరణ కణాల పెరుగుదలపై విభిన్న ప్రభావాలను కలిగి ఉంది.k అపోప్టోసిస్ యాంటీ-PARP యాంటీబాడీతో ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ ద్వారా కనుగొనబడింది.DARS-AS1 యొక్క నాకౌట్ ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా చూపిన విధంగా SW620 కణాల అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది.చూపబడిన డేటా మూడు ప్రయోగాల సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t టెస్ట్ ద్వారా. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t టెస్ట్ ద్వారా. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t-test ద్వారా. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t-test ద్వారా.
మేము PACT అసోసియేషన్‌కు అవసరమైన DARS-AS1 ప్రాంతాన్ని గుర్తించడానికి ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ద్వారా మూడు బయోటైనిలేటెడ్ DARS-AS1 RNA శకలాలను రూపొందించాము (మూర్తి 3e).RNA విశ్లేషణ ఫలితాలు ప్రతి భాగం PACTతో సంకర్షణ చెందగలదని చూపించింది, అయితే 3′-టెర్మినల్ ప్రాంతం (384–768 న్యూక్లియోటైడ్‌లు A3 అని లేబుల్ చేయబడింది) A1 అని లేబుల్ చేయబడిన 1–384 న్యూక్లియోటైడ్‌లను చూపించింది (Fig. 3e).రీకాంబినెంట్ PACT (Figure 3f) ఉపయోగించి ఇన్ విట్రో RIP పరీక్షలో ఇలాంటి ఫలితాలు గమనించబడ్డాయి.ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, BLIని ఉపయోగించి స్థిరీకరించని RNA శకలాలను PACTకి బంధించే ప్రయోగాలు కూడా PACTకి A3 (384–768 nt) (KD విలువ సుమారు 94.6 nM)కి అధిక అనుబంధం ఉందని తేలింది, అయితే ఇతర ప్రాంతాలతో దాదాపుగా ఎలాంటి లింకులు లేవు.(Fig. 3d).
మేము PACTలో అనుబంధిత బైండింగ్ ప్రాంతాలను కూడా పరిశీలించాము.PACT మూడు ఫంక్షనల్ డొమైన్‌లను కలిగి ఉంది, వాటిలో రెండు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ RNA-బైండింగ్ డొమైన్‌లు (dsRBD) మరియు ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్‌ల యాక్టివేటర్‌గా పనిచేసే మూడవ డొమైన్ (నియమించబడిన D3) సంరక్షించబడ్డాయి.ప్రతి డొమైన్ యొక్క lncRNA బైండింగ్ సామర్థ్యాన్ని పరిశీలించడానికి, మేము మూడు మ్యుటేషన్‌లను రూపొందించాము, అవి ప్రతి మూడు డొమైన్‌లను తీసివేసి, ఇన్ విట్రో RIP పరీక్షను నిర్వహించాయి.మా ఫలితాలు PACT యొక్క మూడవ డొమైన్ (D3) యొక్క తొలగింపు ఇతర రెండు ఉత్పరివర్తనలు (Fig. 3h) తో పోల్చితే DARS-AS1 (చెక్కకుండా PACTతో పోలిస్తే 0.11 రెట్లు) దాని పరస్పర చర్యను గణనీయంగా తగ్గించిందని చూపించింది, ఇది విడుదలైనట్లు చూపబడింది. యొక్క D3 DARSతో సంకర్షణ చెందింది.-AC1.కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 మరియు PACT మధ్య పరస్పర చర్య ప్రధానంగా DARS-AS1 యొక్క 3′ ముగింపు మరియు PACT యొక్క D3 డొమైన్ ద్వారా సంభవించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
PACT వ్యక్తీకరణపై DARS-AS1 ప్రభావం లేదని మరియు DARS-AS1పై PACT ప్రభావం లేదని మేము గుర్తించాము (అనుబంధ Fig. 3c).మేము సెల్ పెరుగుదలపై PACT నాక్‌డౌన్ ప్రభావాన్ని పరిశీలించాము.DARS-AS1కి విరుద్ధంగా, PACT పడగొట్టబడినప్పుడు సంబంధిత కణాలు 1.5-3 రెట్లు వేగంగా పెరిగాయి (అనుబంధ Fig. 3d).PACT (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3e)తో shRNA చికిత్స తర్వాత కణాలు 2-3 రెట్లు కాలనీలను ఏర్పరుస్తాయని కాలనీ ఏర్పాటు పరీక్ష ఫలితాలు సూచించాయి.DARS-AS1 PACT ద్వారా సెల్ విస్తరణను నియంత్రిస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము PACT, DARS-AS1 లేదా రెండింటినీ అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే SW620 సెల్‌లను రూపొందించాము.PACT యొక్క అతిగా ప్రసరణ కణాల విస్తరణ యొక్క గణనీయమైన నిరోధాన్ని చూపించింది (మూర్తి 3i).DARS-AS1 ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ పర్ సే గణనీయంగా సెల్ విస్తరణను ప్రోత్సహించినప్పటికీ, DARS-AS1 మరియు PACT లను అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే కణాల పెరుగుదల రేటులో గణనీయమైన తేడా లేదు.ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 అతిగా ఎక్స్‌ప్రెషన్ వల్ల పెరిగిన విస్తరణను PACT ప్రతిఘటించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
DARS-AS1 యొక్క వివిధ ప్రాంతాలు వేర్వేరు PACT-బైండింగ్ సామర్థ్యాలను కలిగి ఉన్నందున, DARS-AS1 శకలాలు వేర్వేరు అతిగా ఎక్స్‌ప్రెషన్ చేయడం ద్వారా కణాల విస్తరణపై వాటి సాపేక్ష ప్రభావాన్ని మేము పరిశోధించాము.ఇతర రెండు శకలాలతో పోలిస్తే, DARS-AS1 3′ ముగింపు (384–768 nt) వద్ద అతిగా ఒత్తిడి చేయబడింది, ఇది DARS-AS1లోని ప్రధాన PACT-సంబంధిత ప్రాంతం, ఇది కణాల విస్తరణను ప్రేరేపించే అత్యధిక సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంది (Fig. 3j).ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 యొక్క బైండింగ్ కెపాసిటీ మరియు బయోలాజికల్ ఫంక్షన్ మధ్య సానుకూల సంబంధాన్ని సూచిస్తాయి.
PACT ప్రో-అపోప్టోటిక్ ప్రోటీన్19గా నివేదించబడింది.కాబట్టి, మేము అపోప్టోసిస్‌పై DARS-AS1 ప్రభావాన్ని పరిశోధించాము.ఊహించినట్లుగా, DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ SW620 కణాలలో PARP చీలికను గణనీయంగా పెంచింది మరియు SW620, HCT116, HepG2 మరియు MBA-MD-231 సెల్ లైన్‌లలో (Fig. 3k) అనెక్సిన్ V-పాజిటివ్ కణాల నిష్పత్తిని పెంచింది.3)3f-h), క్యాన్సర్ కణాలలో DARS-AS1 యొక్క యాంటీ-అపోప్టోటిక్ ప్రభావం PACT యొక్క అపోప్టోసిస్-ప్రేరేపించే ఫంక్షన్‌కు విరుద్ధంగా ఉందని సూచిస్తుంది.కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 ఆంకోజెనిక్ ఫంక్షన్ యొక్క మెకానిజం PACT ఫంక్షన్‌ను నిరోధించడం ద్వారా కావచ్చునని సూచిస్తున్నాయి.
తరువాత, మేము DARS-AS1-PACT అసోసియేషన్ యొక్క క్రియాత్మక చిక్కులను అన్వేషించాము.PACT ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్య ద్వారా PKRని సక్రియం చేస్తుందని నివేదించబడింది, ఇది తదనంతరం eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను మెరుగుపరుస్తుంది, దీని వలన అనువాద తొలగింపు మరియు అపోప్టోసిస్ 17.మొదట, PACT మరియు PKR యొక్క సెల్యులార్ స్థానికీకరణను DARS-AS1 ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో మేము పరిశీలించాము.కాన్ఫోకల్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ సగటు పియర్సన్ సహసంబంధ గుణకం 0.72తో SW620 సెల్‌లలో PACT మరియు PKR ఎక్కువగా కోలోకలైజ్ చేయబడిందని చూపించింది.ఇంతలో, DARS-AS1 అధిక ప్రసరణ PACT మరియు PKR సహ-స్థానికీకరణను గణనీయంగా తగ్గించింది (అంటే పియర్సన్ సహసంబంధ గుణకం 0.61) (మూర్తి 4a).DARS-AS1 PACT-PKR పరస్పర చర్యను మాడ్యులేట్ చేయగలదా అని పరిశోధించడానికి, మేము SW620 సెల్ లైసేట్‌లలో యాంటీ-PACT యాంటీబాడీతో కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (కో-IP) పరీక్షను నిర్వహించాము.PKR నియంత్రణ కణాలలో యాంటీ-PACTలో అధికంగా సమృద్ధిగా ఉంది, అయితే PKR రికవరీ DARS-AS1 (Fig. 4b) ను అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే కణాల నుండి లైసేట్‌లలో గణనీయంగా తగ్గించబడింది.ప్యూరిఫైడ్ లేబుల్ చేయబడిన PACT మరియు PKR విట్రో ప్రోటీన్ బైండింగ్ అస్సేస్ కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి.దీని ప్రకారం, DARS-AS1ని అందించినవి కానీ నియంత్రణ RNA అణచివేయబడిన PACT-PKR పరస్పర చర్యను చూపించలేదు (మూర్తి 4c).DARS-AS1 PACT మరియు PKR కమ్యూనికేషన్‌కు అంతరాయం కలిగించిందని అన్ని ఫలితాలు చూపించాయి.
కాన్ఫోకల్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి నియంత్రణ కణాలు లేదా DARS-AS1ని అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే కణాలలో PACT మరియు PKR యొక్క సహ-స్థానికీకరణ గమనించబడింది.న్యూక్లియైలు DAPI తో తడిసినవి.16 ఛాయాచిత్రాల నుండి గణాంక ఫలితాలు పొందబడ్డాయి.b నియంత్రణ SW620 కణాలు లేదా DARS-AS1ని అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే సెల్ లైసేట్‌లలో యాంటీ-PACT యాంటీబాడీని ఉపయోగించి కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (co-IP).సి లేబుల్ చేయబడిన PACT, శుద్ధి చేయబడిన PKR మరియు DARS-AS1 లేదా మాక్ RNAతో విట్రోలో లిప్యంతరీకరించబడినవి ఇన్ విట్రో ప్రోటీన్ బైండింగ్ విశ్లేషణ కోసం పొదిగేవి.ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ కోసం యాంటీ-ఫ్లాగ్ యాంటీబాడీస్ ఉపయోగించబడ్డాయి.d సూచించిన ప్రతిరోధకాలతో ఇమ్యునోబ్లోట్‌లు SW620 మరియు HCT116 కణాలలో నియంత్రణ shRNA లేదా DARS-AS1-shRNAతో బదిలీ చేయబడ్డాయి, తరువాత సీరం ఆకలితో ఉంటుంది.e DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు సెల్యులార్ సెన్సిటివిటీని టాప్సిగార్గిన్‌కి మార్చాయి.SW620 కణాలు DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్లాస్మిడ్ లేదా కంట్రోల్ ప్లాస్మిడ్‌తో బదిలీ చేయబడ్డాయి.కణాలు 48 గంటల పాటు టాప్సిగార్గిన్‌తో చికిత్స చేయబడ్డాయి మరియు MTS రియాజెంట్ ఉపయోగించి సెల్ ఎబిబిలిటీని నిర్ణయించారు.f ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడిన DARS-AS1 లేదా డమ్మీ RNA మరియు ప్యూరిఫైడ్ PACTలను ఇన్ విట్రో యాక్టివేషన్ అస్సే మరియు ఇమ్యునోబ్లోట్ డిటెక్షన్ కోసం ఉపయోగించారు.g ఈ ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి ఇమ్యునోబ్లోట్‌లు SW620-ctrl కణాలు (ఎడమ) లేదా PKR మార్పుచెందగలవారిని (కుడి) అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే కణాలపై ప్రదర్శించబడ్డాయి.ఈ కణాలు నియంత్రణ shRNA లేదా DARS-AS1-shRNAతో బదిలీ చేయబడ్డాయి, తరువాత సీరం ఆకలితో ఉంటుంది.h ఫ్లో సైటోమెట్రీ SW620 కణాలలో DARS-AS1-ప్రేరిత అపోప్టోసిస్‌కు పరివర్తన చెందిన PKR యొక్క నిష్క్రియం భర్తీ చేయబడిందని చూపించింది.i సూచించిన ప్రతిరోధకాలతో ఇమ్యునోబ్లోట్‌లు SW620 (ఎడమ) లేదా HCT116 (కుడి) కణాలలో ప్రదర్శించబడ్డాయి.నియంత్రణ shRNA లేదా DARS-AS1 shRNAతో బదిలీ చేయబడిన కణాలు సీరం-కోల్పోయినవి మరియు 100 nM PKR C16 ఇన్హిబిటర్ లేదా DMSOతో అనుబంధంగా ఉంటాయి.స్కేల్ బార్ = 5 µm.చూపబడిన డేటా మూడు ప్రయోగాల సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం.* p ≤ 0.05 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్.
ఒకసారి PACT PKR17తో సంకర్షణ చెందితే, Thr451 వద్ద PKR ఫాస్ఫోరైలేషన్ ప్రేరేపించబడుతుందని సాధారణంగా నమ్ముతారు.సీరం ఆకలి (Fig. 4d మరియు అనుబంధ Fig. 4a) తర్వాత DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ కణాలలో PKR ఫాస్ఫోరైలేషన్ స్థాయి గణనీయంగా పెరిగినట్లు మా ఫలితాలు సూచించాయి.దీని ప్రకారం, ప్రధాన PKR సబ్‌స్ట్రేట్ అయిన eIF2α యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్ కూడా DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4a) ద్వారా గణనీయంగా పెంచబడిందని మేము కనుగొన్నాము.తాప్సిగార్గిన్ అనేది ER స్ట్రెస్సర్, దీని వలన ER Ca2+ని విడుదల చేస్తుంది.టాప్సిగార్గిన్‌తో చికిత్స PACT యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు క్రియాశీలతను ప్రేరేపిస్తుందని నివేదించబడింది, ఇది PKRతో మరింత సంకర్షణ చెందుతుంది మరియు సక్రియం చేస్తుంది, eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్ 18,61ని పెంచడం ద్వారా అపోప్టోసిస్‌కు దారితీస్తుంది.ఇక్కడ, PACT/PKR మార్గాన్ని నిరోధించడం ద్వారా కణాలు ఒత్తిడిని అధిగమించడంలో DARS-AS1 సహాయపడుతుందా అని పరిశోధించడానికి మేము PACT/PKR మార్గం యొక్క స్టిమ్యులేటర్‌గా టాప్సిగార్గిన్‌ని ఉపయోగించాము.DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ స్థాయి టాప్సిగార్గిన్‌కు సెల్ రెసిస్టెన్స్‌తో సానుకూలంగా సంబంధం కలిగి ఉందని మేము గమనించాము.DARS-AS1ని అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే SW620 కణాలు టాప్సిగార్గిన్‌తో చికిత్స చేసినప్పుడు మెరుగ్గా మనుగడ సాగించాయి, అయితే DARS-AS1 నాక్‌డౌన్‌తో ఉన్న సెల్‌లు మరింత ఆకర్షనీయంగా మారాయి (Fig. 4e).ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, DARS-AS1 ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ట్యాప్సిగార్గిన్-ప్రేరిత PKR ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను తగ్గించింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4b).దీనికి విరుద్ధంగా, టాప్సిగార్గిన్ చికిత్స తర్వాత, నియంత్రణ కణాలతో పోలిస్తే PKR మరియు eIF2α DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ కణాలలో అధిక స్థాయిలో ఫాస్ఫోరైలేట్ చేయబడ్డాయి (అనుబంధ Fig. 4b).ఆసక్తికరంగా, తప్సిగార్గిన్ DARS-AS1 వ్యక్తీకరణను మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో ప్రేరేపించింది, ఇది DARS-AS1 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4c) యొక్క యాంటీ-స్ట్రెస్ ఫంక్షన్‌ను సూచిస్తుంది.అదనంగా, మేము ఈ పరిశీలనలను నిర్ధారించడానికి ఇన్ విట్రో యాక్టివేషన్ అస్సేస్ చేసాము.క్లుప్తంగా, PKR యాంటీ-పికెఆర్ యాంటీబాడీని ఉపయోగించి సెల్ లైసేట్‌ల నుండి శుద్ధి చేయబడింది, ఆపై రీకాంబినెంట్ PACT మరియు DARS-AS1తో విట్రోలో లిప్యంతరీకరించబడింది.ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్య తర్వాత, ఫాస్ఫో-PKR WBని ఉపయోగించి కనుగొనబడింది.PKR ఫాస్ఫోరైలేషన్ DARS-AS1 ద్వారా గణనీయంగా నిరోధించబడిందని మా ఫలితాలు సూచించాయి, కానీ నియంత్రణ RNA ద్వారా కాదు (మూర్తి 4f).ఇవి ఇన్ విట్రో మరియు ఇన్ వివో ఫలితాలు DARS-AS1 PACT-మెడియేటెడ్ PKR యాక్టివేషన్‌ను నిరోధిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.అదే సమయంలో, DARS-AS1 (Figure 4f) సమక్షంలో PACT రికవరీలో తగ్గుదలని కూడా మేము గమనించాము.ఈ ఫలితం ఇన్ విట్రో ప్రోటీన్ బైండింగ్ అస్సే (Figure 4c) ఫలితాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది మరియు PACT-PKR అసోసియేషన్ కోసం DARS-AS1 యొక్క నిరోధించే పనితీరును మళ్లీ వివరిస్తుంది.
సెల్యులార్ ఒత్తిడిలో PKR యాక్టివేషన్ కోసం PACT యొక్క D3 డొమైన్‌లో Ser246 మరియు Ser287 అవసరం.అలనైన్ కోసం రెండు సెరైన్ అవశేషాల ప్రత్యామ్నాయం ఉత్పరివర్తన చెందిన PACT (mutD)ని అందించింది, ఇది ఒత్తిడి లేనప్పుడు PKRని సక్రియం చేసింది మరియు అలనైన్ (mutA)కి ప్రత్యామ్నాయం ప్రోటోకాల్‌ను తిప్పికొట్టింది.మేము DARS-AS1తో ప్రత్యక్ష అనుబంధంతో ఈ డొమైన్ యొక్క ప్రాముఖ్యతను ప్రదర్శించినందున, ఈ అవశేషాలు DARS-AS1తో పరస్పర చర్యలో కూడా పాల్గొనవచ్చో లేదో పరీక్షించడానికి మేము ఈ రెండు PACT మార్పుచెందగలవారిని రూపొందించాము.ఆసక్తికరంగా, రెండు మార్పుచెందగలవారు DARS-AS1 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4d)కి బంధించే సామర్థ్యాన్ని కోల్పోయారు, DARS-AS1తో సమర్థవంతమైన పరస్పర చర్య కోసం PACT ప్రోటీన్ యొక్క పూర్తి నిర్మాణం అవసరమని సూచిస్తుంది.
ఇంకా, మా ఫలితాలు DARS-AS1-shRNA- ప్రేరిత కణాల విస్తరణ నిరోధాన్ని ఆధిపత్య ప్రతికూల PACT ఉత్పరివర్తన (PACTmutA) లేదా ఆధిపత్య ప్రతికూల PKR ఉత్పరివర్తన (PKRmut) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4e. ఇ) అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేయడం ద్వారా పాక్షికంగా పునరుద్ధరించబడవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.డామినెంట్-నెగటివ్ PKR మార్పుచెందగలవారి అధిక ప్రసరణ DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన PKR ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను అలాగే సీరం-కోల్పోయిన కణాలలో eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను తగ్గించింది (Fig. 4g).మరీ ముఖ్యంగా, DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన అపోప్టోటిక్ కణాల నిష్పత్తి PKRmut (Fig. 4h మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4g)ను అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే కణాలలో కూడా తగ్గించబడింది.PKR కినేస్ కార్యకలాపాల నిరోధం DARS-AS1 పనితీరును కూడా దెబ్బతీస్తుంది, ఎందుకంటే PKR-నిర్దిష్ట C16 ఇన్హిబిటర్ (Fig. 4i మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4h)తో కణాలు చికిత్స చేసినప్పుడు DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ అరుదుగా PKR మరియు eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను ప్రేరేపించిందని ఫలితాలు చూపించాయి.)కలిసి చూస్తే, PACT-మధ్యవర్తిత్వ PKR యాక్టివేషన్‌ను నిరోధించడం ద్వారా DARS-AS1 సెల్ విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుందని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
ట్యూమోరిజెనిసిస్‌లో DARS-AS1 పాత్రను మరింత అన్వేషించడానికి, మేము మౌస్ జెనోగ్రాఫ్ట్ మోడల్‌ని ఉపయోగించి వివో ప్రయోగాలలో ప్రదర్శించాము. DARS-AS1 యొక్క నాక్‌డౌన్ ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదల నాటకీయంగా తగ్గిందని ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (p విలువ <0.0001) (Fig. 5a). DARS-AS1 యొక్క నాక్‌డౌన్ ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదల నాటకీయంగా తగ్గిందని ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (p విలువ <0.0001) (Fig. 5a). రెజుల్తాటి ఫోకస్యూట్, చుటో నోక్‌డౌన్ DARS-AS1 రెజ్‌కో స్నిజాయెట్ రోస్ట్ ఒపుహొలి యు మైషెయ్ (జాన్‌చెని పే <0,0001) DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదలను బాగా తగ్గిస్తుందని ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి (p విలువ <0.0001) (మూర్తి 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）దాదాపు రెజుల్టటీ పోకజాలి, CHTO NOKDAUN DARS-AS1 genchitelno snizaet rost oppuholli u мшей (జానచెనీ 100,000). DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదలను గణనీయంగా తగ్గించిందని ఫలితాలు చూపించాయి (p విలువ <0.0001) (మూర్తి 5a).అందువలన, DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ సమూహంలో, సగటు కణితి పరిమాణంలో 72.9% మరియు సగటు కణితి ద్రవ్యరాశి 87.8% (మూర్తి 5b-d) గణనీయంగా తగ్గింది.DARS-AS1 వివోలో కణితి పెరుగుదలను గణనీయంగా ప్రోత్సహిస్తుందని ఈ ఫలితాలు గట్టిగా సూచిస్తున్నాయి.
నగ్న ఎలుకలలో కొలొరెక్టల్ ఆంకోజెనిసిస్‌పై ప్రకటన DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ ప్రభావాలు.పెరుగుదల వక్రతలు (ఎ), కణితి పరిమాణం (బి), బరువు (సి) మరియు కణితి చిత్రాలు (డి) చూపబడ్డాయి.లోపం పట్టీలు ± SEMని సూచిస్తాయి. n = 10. ****p <0.0001, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t టెస్ట్ ద్వారా. n = 10. ****p <0.0001, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ t టెస్ట్ ద్వారా. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్.n = 10. ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001,通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్.ఇ కప్లాన్-మీర్ UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM మరియు LGG ఉన్న రోగులలో DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు మరియు మొత్తం మనుగడ మధ్య పరస్పర సంబంధాన్ని విశ్లేషించారు.రోగులలో DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ యొక్క అధిక స్థాయిలు టాప్ 50%లో ఉన్నాయి;రోగులలో DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ యొక్క తక్కువ స్థాయి 50% దిగువన ఉంది.p-విలువలు లాగ్ ర్యాంక్ పరీక్షను ఉపయోగించి నిర్ణయించబడ్డాయి.f ప్రతిపాదిత నమూనాలో DARS-AS1 PACT-PKR మార్గం మరియు కణితి పెరుగుదలను నియంత్రిస్తుంది.
DARS-AS1 యొక్క క్లినికల్ ప్రభావాన్ని బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము దాని వ్యక్తీకరణ మరియు రోగి మనుగడ మధ్య పరస్పర సంబంధాన్ని పరిశీలించాము.TCGA డేటాసెట్‌ను విశ్లేషించడం ద్వారా, అధిక DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ యువల్ మెలనోమా (UVM), మూత్రపిండ క్రోమోఫోబియా (KICH), మూత్రపిండ పాపిల్లరీ సెల్ కార్సినోమా (KIRP), మెసోథెలియోమా (MESO), మల్టీప్లెక్స్‌తో అనుబంధించబడిందని మేము కనుగొన్నాము.తక్కువ మనుగడ గ్లియోబ్లాస్టోమా మోర్ఫోసిస్ (GBM) మరియు తక్కువ-గ్రేడ్ బ్రెయిన్ గ్లియోమా (LGG) ఉన్న రోగులతో గణనీయంగా సంబంధం కలిగి ఉంది (మూర్తి 5e).క్లినికల్ ట్యూమర్ పురోగతిలో DARS-AS1 ఒక ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని మరియు బహుళ క్యాన్సర్‌లలో సంభావ్య అంచనా బయోమార్కర్ కావచ్చునని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
ఈ అధ్యయనంలో, పెద్ద-స్థాయి CRISPRi ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్‌ని ఉపయోగించి, PACT మరియు PKR అనే రెండు కీలక ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలను నియంత్రించడం ద్వారా DARS-AS1 lncRNA క్యాన్సర్ కణ ఒత్తిడిని అధిగమిస్తుందని మేము గుర్తించాము.PACTతో నేరుగా పరస్పర చర్య చేయడం ద్వారా, DARS-AS1 PACT-మధ్యవర్తిత్వ PKR క్రియాశీలతను నిరోధిస్తుంది, తద్వారా అపోప్టోటిక్ కణాల మరణాన్ని నిరోధించడం మరియు కణాల విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుంది (Fig. 5f).DARS-AS1 యొక్క అధిక నియంత్రణ అనేక రకాల క్యాన్సర్‌లలో గమనించబడింది, ఒత్తిడితో కూడిన పరిస్థితులలో క్యాన్సర్ కణాల మనుగడను ప్రోత్సహించే దాని పనితీరు అనేక రకాల క్యాన్సర్‌లకు విస్తృతంగా వర్తించవచ్చని సూచిస్తుంది.
PACT ఒక PKR యాక్టివేటర్ ప్రోటీన్‌గా గుర్తించబడింది మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్, అనువాదం, అపోప్టోసిస్ మరియు ఇతర ముఖ్యమైన సెల్యులార్ ప్రక్రియలను నియంత్రించడం ద్వారా ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలలో PACT-మధ్యవర్తిత్వ PKR యాక్టివేషన్ ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది.దశాబ్దాలుగా, PACT-PKR క్యాస్కేడ్ యొక్క క్యాన్సర్-నిర్దిష్ట నియంత్రణను అర్థం చేసుకోవడానికి ప్రయత్నాలు జరిగాయి.ఇక్కడ, మా అధ్యయనం సెల్యులార్ lncRNA DARS-AS1 ద్వారా క్యాన్సర్ కణాలలో PACT-PKR నియంత్రణ యొక్క విభిన్న యంత్రాంగాన్ని వెల్లడించింది, ఇది నేరుగా PACTతో బంధిస్తుంది, PACT-PKR పరస్పర చర్యను అడ్డుకుంటుంది, PKR యాక్టివేషన్ మరియు eIF2α ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను నిరోధిస్తుంది, తద్వారా ఒత్తిడి-ప్రేరిత అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధిస్తుంది. చివరికి క్యాన్సర్ విస్తరణను ప్రేరేపిస్తుంది.కణాలు.ఈ ఆవిష్కరణ క్యాన్సర్ రోగ నిరూపణ మరియు చికిత్స కోసం సంభావ్య lncRNA లక్ష్యాలపై వెలుగునిస్తుంది.
ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ PKR మరియు eIF2αలలో గణనీయమైన పెరుగుదలతో DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ కణాలను సీరం ఆకలికి సున్నితం చేస్తుందని మా డేటా చూపించింది.ఈ ఫలితాలు DARS-AS1 PACT/PKR కార్యాచరణను నిరోధించడం ద్వారా కఠినమైన పరిస్థితులలో క్యాన్సర్ కణాల మనుగడను ప్రోత్సహిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.ASPACT మరియు nc886 వంటి అనేక ఇతర నాన్-కోడింగ్ RNAలు కూడా PACT48 mRNAని తగ్గించడం ద్వారా లేదా PKR49,50,64కి బంధించడం ద్వారా ఆటోఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను నియంత్రించడం ద్వారా PACT/PKR అక్షంలో పాల్గొంటాయి.వాటిలో, DARS-AS1 PACT-PKR అసోసియేషన్‌కు అంతరాయం కలిగించేదిగా పనిచేస్తుంది.ఈ అధ్యయనం PACT/PKR యాక్సిస్ రెగ్యులేషన్ మరియు ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలలో lncRNAల పాత్రపై మన అవగాహనను మెరుగుపరుస్తుంది.
PACT మూడు వేర్వేరు డొమైన్‌లను కలిగి ఉంది.మొదటి రెండు dsRBDలలో ప్రతి ఒక్కటి PKRకి PACT యొక్క అధిక అనుబంధాన్ని సాధించడానికి సరిపోతుంది, అయితే మూడవ డొమైన్ (D3) విట్రో మరియు వివోలో PKR యాక్టివేషన్ కోసం అవసరం.మా అధ్యయనం DARS-AS1 ప్రాధాన్యంగా D3 డొమైన్‌తో సంకర్షణ చెందుతుందని చూపించింది (Fig. 3h).lncRNA (768 న్యూక్లియోటైడ్‌లు) యొక్క పెద్ద పరిమాణాన్ని బట్టి, D3కి DARS-AS1 బైండింగ్ dsRBD మరియు PKR యొక్క PACT డొమైన్ మధ్య పరస్పర చర్యను భౌతికంగా నిరోధిస్తుంది, తద్వారా PACT మరియు PKR యొక్క అనుబంధాన్ని నిరోధించవచ్చు.D3లోని Ser246 మరియు Ser287లను అలనైన్ లేదా అస్పార్టేట్‌తో భర్తీ చేసిన PACT పాయింట్ మ్యుటేషన్‌లు DARS-AS1కి దాని బంధన అనుబంధాన్ని భంగపరిచాయి, వాటి అనుబంధంలో D3 యొక్క మొత్తం నిర్మాణ మరియు విద్యుత్ లక్షణాల యొక్క ప్రాముఖ్యతను సూచిస్తుంది.మరింత ఖచ్చితమైన జీవరసాయన విశ్లేషణ మరియు అధిక రిజల్యూషన్ PACT నిర్మాణ విశ్లేషణను ఉపయోగించి భవిష్యత్తులో ఈ మెకానిజం యొక్క మరిన్ని వివరాలు అవసరం.
మునుపటి అధ్యయనాలు DARS-AS1 అనేక యంత్రాంగాల ద్వారా కణాల విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుందని నివేదించాయి 51,52,53.ఒక ఉదాహరణలో, కిడ్నీ క్యాన్సర్ కణాలలో miP-194-5pని లక్ష్యంగా చేసుకోవడం ద్వారా DARS-AS1 దాని యాంటిసెన్స్ ప్రోటీన్-ఎన్‌కోడింగ్ DARS జన్యువును అధికం చేసిందని పరిశోధకులు గమనించారు.అయితే, ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, DARS-AS1 నాక్‌డౌన్ కనీసం కొలొరెక్టల్, బ్రెస్ట్ మరియు లివర్ క్యాన్సర్‌లతో సహా పలు రకాల క్యాన్సర్‌లలో DARS ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌పై తక్కువ ప్రభావాన్ని చూపింది.lncRNA లు సెల్- మరియు కణజాల-నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ నమూనాలను ప్రదర్శిస్తాయి కాబట్టి, క్యాన్సర్ రకాల్లో ఫంక్షనల్ మెకానిజమ్‌లు సంరక్షించబడకపోవచ్చు, ఇది మా పరిశీలనలు మరియు వివిధ క్యాన్సర్‌ల మునుపటి అంచనాల మధ్య ఈ వ్యత్యాసానికి దోహదం చేస్తుంది.వివిధ శారీరక మరియు రోగలక్షణ ప్రక్రియల యొక్క నిర్దిష్ట విధానాలను వివరించడానికి ప్రత్యేక అధ్యయనాలు అవసరం.
కణితుల్లోని DARS-AS1 వ్యక్తీకరణ క్యాన్సర్ రోగుల మనుగడతో విలోమ సంబంధం కలిగి ఉందని క్లినికల్ డేటా యొక్క విశ్లేషణ చూపించింది, ఇది క్యాన్సర్ రోగ నిరూపణలో DARS-AS1/PACT/PKR అక్షం యొక్క ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతుంది.ముగింపులో, మా అధ్యయనం DARS-AS1 అనేది PACT/PKR సిగ్నలింగ్ అక్షం యొక్క నియంత్రకం అని చూపిస్తుంది, క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణను ప్రోత్సహిస్తుంది మరియు ఒత్తిడి ప్రతిస్పందన సమయంలో అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధిస్తుంది, ఇది మరొక పరిశోధన లైన్‌ను అందిస్తుంది మరియు సంభావ్య చికిత్సలపై భవిష్యత్ పరిశోధనలకు ఆసక్తిని కలిగిస్తుంది. .
మానవ సెల్ లైన్లు SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 మరియు HEK293T చైనాలోని నేషనల్ సెల్ లైన్ రిసోర్స్ ఇన్‌ఫ్రాస్ట్రక్చర్ నుండి పొందబడ్డాయి.అన్ని కణాలు DMEM మాధ్యమంలో (DMEM, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్తామ్, MA) 10% FBS (జెమిని, బ్రూక్లిన్, NY) మరియు 1% పెన్సిలిన్-స్ట్రెప్టోమైసిన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) 37°C, 5% CO2తో అనుబంధంగా నిర్వహించబడ్డాయి.ఇంక్యుబేటర్.
యాంటీ-పాక్ట్, అబ్కామ్ (ab31967);యాంటీ-పికెఆర్, అబ్కామ్ (ab184257);వ్యతిరేక PKR (ఫాస్ఫో-T451), అబ్కామ్ (ab81303);యాంటీ-ఫ్లాగ్, అబ్కామ్ (ab125243);వ్యతిరేక eIF2α, Abcam (A0764)) ;వ్యతిరేక eIF2α (ఫాస్పరస్ S51), Abcam (ab32157);యాంటీ-PACT (ఫాస్పరస్ S246), అబ్జెంట్ (AP7744b);వ్యతిరేక β-tubulin, CST (2128);సాధారణ మౌస్ IgG, CST (5415S);సాధారణ కుందేలు IgG, CST (2729S).పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ కోసం PBSTలో 1:1000 మరియు IP కోసం 1:100 ప్రతిరోధకాలు పలుచన చేయబడ్డాయి.
sgRNAలు CRISPR-ERA66 అనే పబ్లిక్‌గా అందుబాటులో ఉన్న సాధనాన్ని ఉపయోగించి అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి.మేము sgRNA డెవలప్‌మెంట్ కోసం డిఫాల్ట్ టూల్ పారామితులను మరియు 3 kb ప్రాంతంలో అల్గోరిథం కంప్యూటెడ్ sgRNA బైండింగ్ సైట్‌లను ఉపయోగించాము.TSSలో కేంద్రీకృతమై ఉంది.sgRNA ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల కొలనులు CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) వద్ద సంశ్లేషణ చేయబడ్డాయి మరియు మానవీకరించిన pgRNA ప్లాస్మిడ్‌లుగా (Addgene #44248) క్లోన్ చేయబడ్డాయి.మొత్తం 12 µg పూల్ చేయబడిన హ్యూమనైజ్డ్ pgRNA ప్లాస్మిడ్, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), మరియు 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 1036 సెం.మీ డిస్‌ఫెక్ట్ DNAలోకి 5 x 1036 సెం.మీ డిస్‌ఫెక్ట్ డిఎన్‌ఎను ఉపయోగించి సహ-బదిలీ చేయబడ్డాయి. సెల్‌లు (CWBIO, బీజింగ్, చైనా) తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి.వైరస్-కలిగిన సూపర్‌నాటెంట్‌లు బదిలీ అయిన 48 మరియు 72 గంటల తర్వాత సేకరించబడ్డాయి మరియు 0.45 µm ఫిల్టర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి.స్క్రీనింగ్ కోసం, dCas9/KRAB ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌ను వ్యక్తీకరించే SW620 కణాలు వైరస్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ ద్వారా పొందబడ్డాయి.0.1-0.3 MOI వద్ద నాలుగు స్వతంత్ర సంక్రమణ ప్రయోగాలలో సవరించిన SW620 కణాలు వైరస్ లైబ్రరీతో సోకాయి మరియు 2 రోజుల పాటు 2 μg/ml ప్యూరోమైసిన్ (సిగ్మా, సెయింట్ లూయిస్, MO)తో నమూనా చేయబడ్డాయి.ఆ తర్వాత, స్క్రీనింగ్ కోసం కనిష్టంగా 500 సెల్స్/sgRNA లైబ్రరీ కవరేజీతో కణాలు 18 రోజుల పాటు విట్రోలో కల్చర్ చేయబడ్డాయి.
QIAamp DNA బ్లడ్ మిడి కిట్ (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) సూచనల ప్రకారం జెనోమిక్ DNA సంగ్రహించబడింది.మొత్తంగా, లైబ్రరీని నిర్మించడానికి బయోలాజికల్ రిపీట్‌కు 100 μg జన్యుసంబంధమైన DNA ఉపయోగించబడింది.sgRNA ప్రాంతం రెండు రౌండ్ల PCR ద్వారా విస్తరించబడింది మరియు బార్‌కోడ్‌కి లింక్ చేయబడింది.
PCR ఉత్పత్తులు NucleoSpin® జెల్ మరియు PCR ప్యూరిఫికేషన్ కిట్ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) ఉపయోగించి శుద్ధి చేయబడ్డాయి మరియు Qubit™ HS డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA డిటెక్షన్ కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్; Q32854) ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి.
సెల్ విస్తరణను కొలవడానికి MTS పరీక్ష ఉపయోగించబడింది.2000 కణాలు/బావి ప్రారంభ సాంద్రతతో 96-బావి పలకలలో కణాలు సీడ్ చేయబడ్డాయి.మొత్తం 4-6 రోజుల పాటు సూచించిన సమయంలో కణాల సాపేక్ష సంఖ్య ప్రతిరోజూ కొలుస్తారు.ప్రతి బావికి, 20 μl MTS రియాజెంట్ (ప్రోమెగా) 100 μl DMEM తో కరిగించబడుతుంది, 37 ° C వద్ద 4 గం వరకు కణాలతో పొదిగేది, ఆపై OD490 కొలుస్తారు.
గోళాల ఏర్పాటును విశ్లేషించడం ద్వారా అన్‌యాంకర్డ్ వృద్ధి సామర్థ్యం కనుగొనబడింది.క్లుప్తంగా, shRNA DARS-AS1 లేదా కంట్రోల్ shRNAతో బదిలీ చేయబడిన 2000 కణాలు ప్రతి 4 రోజులకు మధ్యస్థ మార్పుతో అల్ట్రా తక్కువ అటాచ్‌మెంట్ మైక్రోప్లేట్‌లలో (కార్నింగ్) కల్చర్ చేయబడ్డాయి.గోళాకారాలు 14 రోజుల తర్వాత లెక్కించబడ్డాయి.DARS-AS1 ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్లాస్మిడ్ లేదా కంట్రోల్ ప్లాస్మిడ్‌తో బదిలీ చేయబడిన 500 కణాలు మెరుగుదల పరీక్ష కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి, లేకపోతే పద్ధతి మారదు.
Riboprobe® కాంబినేషన్ సిస్టమ్స్ (Promega P1440) సూచనల ప్రకారం T7 RNA పాలిమరేస్ మరియు బయోటిన్-16-UTP (రోచె 1138908910) ఉపయోగించి RNA లిప్యంతరీకరించబడింది.ఇక్కడ ఉపయోగించిన ప్రైమర్‌లు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 4లో ఇవ్వబడ్డాయి.
ప్రోటీన్-కోడింగ్ PACT లేదా PKR ప్రాంతాలు pET15b (Addgene #73619)లోకి క్లోన్ చేయబడ్డాయి మరియు BL21(DE3)గా రూపాంతరం చెందాయి.యాంపిసిలిన్‌తో సరఫరా చేయబడిన ఎల్‌బిలో బ్యాక్టీరియా రాత్రిపూట పొదిగేది మరియు తాజా ఎల్‌బితో 100 రెట్లు కరిగించబడుతుంది.మాధ్యమం యొక్క OD600 0.8కి చేరుకున్నప్పుడు, ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించడానికి 1 mM IPTG జోడించబడింది.సున్నితమైన వణుకు (20 ° C వద్ద 250 rpm)తో రాత్రిపూట పొదిగిన తర్వాత, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ (4000 rpm, 10 నిమి, 4 ° C) ద్వారా సెల్ గుళికలు సేకరించబడ్డాయి.లైసిస్ బఫర్ (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF)లో సెల్ పెల్లెట్‌ను మళ్లీ సస్పెండ్ చేయండి మరియు మంచు మీద 30 నిమిషాలు పొదిగేది, ఆపై సోనికేట్ (15 నిమి, 5 సె ఆన్/ఆఫ్, మంచు మీద) మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ (13,000 rpm)., 30 నిమి, 4°С).సూపర్‌నాటెంట్ అప్పుడు 4°C వద్ద Ni-NTA రెసిన్ (QIAGEN)లో 3 సార్లు లోడ్ చేయబడింది, వాష్ బఫర్‌తో 4 సార్లు కడిగి (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM ఇమిడాజోల్, 250 mM NaCl) మరియు మొత్తం 3 సార్లు ఎల్యూట్ చేయబడింది. 10 ml ఎలుయెంట్ బఫర్ (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM ఇమిడాజోల్).WB ఉపయోగించి శుద్ధి చేయబడిన ప్రోటీన్ నిర్ణయించబడింది మరియు Qubit™ ప్రోటీన్ అస్సే కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్; Q 33212) ఉపయోగించి ఏకాగ్రత నిర్ణయించబడింది.
గతంలో వివరించిన విధంగా మార్పులతో RIP పరీక్షలు జరిగాయి.క్లుప్తంగా, 1x RIP బఫర్ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin రిబోన్యూక్లీస్ ఇన్హిబిటర్ (ప్రోమెగా), PMSF (బయోటైమ్ బయోటెక్నాలజీ), 1 mM DDM, కోటెయిల్ 1 ప్రొటీస్ 1000 ప్రోటీస్) (రోచె, 1 mM DTT) మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ 13,000 rpm వద్ద 4 °C వద్ద 15 నిమిషాలు.సూపర్‌నాటెంట్‌ను 5 μg యాంటీ-PACT యాంటీబాడీ (అబీమ్) లేదా IgG (CST)తో కలిపి ప్రోటీన్ A+G మాగ్నెటిక్ పూసలతో (మిల్లిపోర్) పొదిగించారు.పూసలను 5x RIP బఫర్‌తో 5 సార్లు కడుగుతారు, తర్వాత ప్రొటీనేజ్ K (NEB)తో జీర్ణం చేస్తారు.RNA ట్రైజోల్‌తో సంగ్రహించబడింది మరియు RT-qPCR ద్వారా నిర్ణయించబడింది.ప్రైమర్‌లు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 5లో ప్రదర్శించబడ్డాయి.
ఇన్ విట్రో RIP పరీక్ష సవరించిన ప్రామాణిక RIP పరీక్ష ప్రోటోకాల్ ప్రకారం నిర్వహించబడింది.మొత్తం 5 pmol ఇన్ విట్రో ట్రాన్స్‌క్రిప్టెడ్ RNA RIP బఫర్‌తో 1x కరిగించబడుతుంది మరియు 65 ° C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేషన్ ద్వారా ఎనియల్ చేయబడింది, తర్వాత గది ఉష్ణోగ్రతకు నెమ్మదిగా చల్లబడుతుంది.E. coli నుండి మొత్తం 5 pmol చెక్కుచెదరకుండా లేదా పరివర్తన చెందిన ఫ్లాగ్-లేబుల్ చేయబడిన PACT ప్రోటీన్లు శుద్ధి చేయబడ్డాయి.4°C వద్ద 2 గంటల పాటు పునర్నిర్మించిన RNAతో పొదిగే మరియు యాంటీ-ఫ్లాగ్ IP కోసం RIP విశ్లేషణ కోసం పై విధానాన్ని అనుసరించండి.
RNA పొడిగింపు విశ్లేషణ కోసం, 1xRIP బఫర్‌తో 1×107 కణాలు లైస్ చేయబడ్డాయి.4°C వద్ద 15 నిమిషాలకు 13,000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, సూపర్‌నాటెంట్‌ను 30 μl స్ట్రెప్టావిడిన్ మాగ్నెటిక్ పూసలతో (బెక్‌మాన్) 4 ° C వద్ద 2 గం వరకు ప్రీట్రీట్ చేశారు.శుద్ధి చేయబడిన లైసేట్ ఈస్ట్ tRNAతో సరఫరా చేయబడింది మరియు 40 pmol రీనేచర్డ్ RNAతో రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద పొదిగేది, తర్వాత మరో 2 గంటలు మరియు BSAతో నిరోధించబడిన 20 μl కొత్త స్ట్రెప్టావిడిన్ మాగ్నెటిక్ పూసలు జోడించబడ్డాయి.వాషింగ్ స్టెప్ 5x RIP బఫర్‌తో 4 సార్లు మరియు 1x RIP బఫర్‌తో 4 సార్లు ఉంటుంది.సంబంధిత ప్రోటీన్లు బయోటిన్ ఎలుషన్ బఫర్ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-బయోటిన్, PMSF)తో తొలగించబడ్డాయి మరియు NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (ఇన్విట్రోజెన్)పై వేరు చేయబడ్డాయి.సిల్వర్ స్టెయినింగ్ (బయోటైమ్ బయోటెక్నాలజీ) తర్వాత, కొన్ని బ్యాండ్‌లు MS చేత ఎక్సైజ్ చేయబడ్డాయి మరియు విశ్లేషించబడ్డాయి.
PACT మరియు PKR మధ్య పరస్పర చర్యను పరీక్షించడానికి సహ-IP విశ్లేషణ జరిగింది.క్లుప్తంగా, 1 x RIP బఫర్‌లో 1 x 107 లైస్డ్ కణాలను పొదిగించడం ద్వారా సూపర్‌నాటెంట్ లైసేట్‌లు తయారు చేయబడ్డాయి, తరువాత 13,000 rpm వద్ద 4 ° C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేయబడుతుంది.లైసేట్‌లు ప్రోటీన్ A + G మాగ్నెటిక్ పూసలతో లోడ్ చేయబడ్డాయి, 5 µg యాంటీ-PACT యాంటీబాడీతో సంయోగం చేయబడ్డాయి మరియు రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద సున్నితంగా తిప్పబడ్డాయి.పూసలు 5×RIP బఫర్‌తో 3 సార్లు, 1×RIP బఫర్‌తో రెండుసార్లు కడుగుతారు మరియు 1×SDS బఫర్‌తో ఎల్యూట్ చేయబడ్డాయి.కోలుకున్న ప్రోటీన్ SDS-PAGE జెల్ ద్వారా విశ్లేషించబడింది మరియు WB ద్వారా కనుగొనబడింది.
ఫ్లాగ్ చేయబడిన PACT యొక్క రెండు pmol మరియు PKR యొక్క 1 pmol E. coli నుండి శుద్ధి చేయబడ్డాయి.1× RIP బఫర్‌లో పలుచన చేసి, 4 °C వద్ద 2 గంటల పాటు రీనేచర్డ్ RNA యొక్క 10 pmolతో పొదిగేది.ఆ తరువాత, అవి ప్రోటీన్ A+G మాగ్నెటిక్ బీడ్-కంజుగేటెడ్ యాంటీ-లేబుల్ యాంటీబాడీతో అదనంగా రెండు గంటల పాటు పొదిగేవి.పూసలు 1x RIP బఫర్‌తో నాలుగు సార్లు కడుగుతారు మరియు 1x SDS బఫర్‌తో తొలగించబడ్డాయి.ఫలితంగా PACT మరియు PKR WB ద్వారా కనుగొనబడ్డాయి.